Hög genomströmning Screening av motsträvighet Variationer i lignocellulosabiomassa: Total Lignin, Lignin monomerer, och enzymatisk Sugar Release
Summary
Plant cell wall structure and chemistry traits are evaluated to identify ideal feedstocks for biofuels and bio-materials. Standard methods have limitations when applied to large data sets. These high-throughput pretreatment, enzyme saccharification, and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry methods compare large numbers of biomass samples with decreased experimental time and cost.
Abstract
The conversion of lignocellulosic biomass to fuels, chemicals, and other commodities has been explored as one possible pathway toward reductions in the use of non-renewable energy sources. In order to identify which plants, out of a diverse pool, have the desired chemical traits for downstream applications, attributes, such as cellulose and lignin content, or monomeric sugar release following an enzymatic saccharification, must be compared. The experimental and data analysis protocols of the standard methods of analysis can be time-consuming, thereby limiting the number of samples that can be measured. High-throughput (HTP) methods alleviate the shortcomings of the standard methods, and permit the rapid screening of available samples to isolate those possessing the desired traits. This study illustrates the HTP sugar release and pyrolysis-molecular beam mass spectrometry pipelines employed at the National Renewable Energy Lab. These pipelines have enabled the efficient assessment of thousands of plants while decreasing experimental time and costs through reductions in labor and consumables.
Introduction
Som den globala tillgången på icke-förnybara bränslen och tillhörande produkter minskar, har forskare ifrågasatts för att skapa likartade bränslen och kemikalier från vegetabiliska källor 1. En viktig del i detta arbete är att bestämma vilka arter av växter kan vara lämpliga för produktion av biobränslen och biomaterial 2,3. Normalt är dessa utgångsmaterial utvärderades beträffande lignin, cellulosa och hemicellulosa; liksom deras känslighet för dekonstruktion (motsträvighet) genom termisk, mekanisk och / eller kemisk förbehandling med eller utan efterföljande enzym försockring. Mer detaljerade analyser används för att bestämma den specifika sammansättningen av ligninet och hemicellulosan fraktioner samt optimala enzymaktiviteter behövs. Transgena modifieringar av växter som inte i sig besitter ideala egenskaper för biokemisk eller termokemisk omvandling till önskade råvaror har gett forskare med en kraftigt utökad källa av pottenrential- matarmaterial 4. De analytiska standardmetoder för att kvantifiera de kemiska egenskaper hos en växt, medan ganska användbart för små provmängder, är olämpliga för snabb screening av hundratals eller tusentals prover 5-7. De HTP metoderna beskrivna häri har utvecklats för att snabbt och effektivt utvärdera ett stort antal varianter biomassa för förändringar i cellväggen motsträvighet till termokemisk och / eller enzymatisk nedbrytning.
Det är viktigt att förstå att de HTP screeningsanalyser beskrivna häri har inte utformats för att maximera omvandling eller utbyte. Målet är att bestämma relativa skillnader i inneboende motsträvighet av relaterade prover biomassa. Som ett resultat, många av analysstegen skiljer sig från de "typiska" konvertering biomassa analyser, där målet är att få maximal omräkningskurs eller omfattning. Till exempel är lägre förbehandlingssträng och kortare enzym hydrolystider används för att maximera skiljerderna mellan prover. I de flesta fall är relativt höga enzymbelastningar som används för att minska skillnaderna på grund av experimentell variation i enzymaktivitet, vilket skulle kunna förvränga resultaten avsevärt.
Snabba metoder för att bestämma sammansättningen av växtcellväggar och de monomera socker frigörs efter enzymatisk försockring inkluderar robotik, skräddarsy, termo kompatibla 96-brunnsplattor, och modifieringar av standardlaboratoriemetoder 8-11 och instrumentprotokoll, såsom vibrationsspektroskopi (IR (IR), nära-infraröd (NIR) eller Raman) och kärnmagnetisk resonans (NMR) 12-17. Dessa metoder är nyckeln till att isolera råvaror med hög cellulosa eller låg lignininnehåll, eller de förväntas ge den högsta glukos, xylos, etanol, etc. Dessa metoder har gjort det möjligt nedskalade analyser som använder mindre mängder biomassa och förbrukningsartiklar, vilket leder till en minskning i experimentell bekostnad 18 </supp>. Ett annat särdrag hos denna metodologiska tillvägagångssätt är att olika experimentella förhållanden kan vara snabbt, och i vissa fall samtidigt, utvärderas. Till exempel kan en mängd olika förbehandlings strategier eller enzym cocktails testas, vilket gör att de mest optimala experimentella parametrar som ska snabbt identifieras och utnyttjas. Populära matarmaterial, såsom majsstjälkar 9, poppel 8,10, sockerrör bagass 8, och switch 8 har framgångsrikt utvärderats med användning av dessa HTP metoder.
Total lignin och lignin monomersammansättning är också vanligt kvantifieras drag biomassa. Minskningar i ligninhalt har visat sig öka den enzymatiska smältbarhet polysackarider 19,20. Den roll som ligninet mono förhållandet (ofta rapporteras som syringyl / guaiacyl (S / G) innehåll) spelar i dekonstruktion av växtcellväggen är fortfarande under utredning. Vissa rapporter har visat att minskningar i S / GFörhållandet ledde till ökade glukos ger efter hydrolys 21, medan andra studier avslöja en motsatt utveckling 19,22. Hög genomströmning metoder för utvärdering lignin och dess monomerer innefattar vibrationsspektroskopi (IR, NIR och Raman 23-26) i kombination med multivariat analys, och pyrolys molekylstråle masspektrometri (pyMBMS) 27,28.
När man utvecklar HTP metoder för screening av biomassa, flera integrerade överväganden måste hållas i åtanke. En viktig aspekt är komplexiteten av förfarandet. Vad är det som krävs kompetensnivå för tekniken? Kemometriska analyser, till exempel, kräver särskilda kunskaper för att konstruera, utvärdering, och upprätthålla prediktiva modeller. De standardmetoder uppvisar oönskade förberedande eller dataanalyssteg eller anställa toxiska reagens. Utveckling av modellerna är en kontinuerlig process där nya data införlivas i modellen över tiden för att öka modellens robusthet. En annan Considbete är kostnadsbesparingar och minskad experimentella analystider för de föreslagna hög genomströmning metoder. Om metoden är ganska snabb, men mycket kostsamt, kan det inte vara en genomförbar teknik för många laboratorier att anta. De metoder som illustreras i detta manuskript är varianter av standardiserade tekniker, modifierade för att förstärka genomströmningskapacitet. Dessa protokoll mäta kvantitativt biomassa drag av intresse utan kräver utvecklingen av prediktiva modeller. Detta är en viktig egenskap hos dessa tekniker, eftersom prediktiva metoder, samtidigt uppvisar starka samband med standarden analyser används för att utveckla modellerna, är inte lika exakt som faktiskt mäta mängden av intresse för proven. De metoder som används är väsentligen förminskad versioner av standardbänkskale analysmetoder, är noggrannhet och precision handlas för hastighet och genomströmning. Mestadels är detta resultat beror på högre fel i liten volym pipettering och vägning; samt ökad sriklig heterogenitet som urvalsstorleken minskar. Medan stora provmängder kan screenas och jämföras, måste stor försiktighet iakttas när man gör jämförelser mellan separata kampanjer och till bänkskale resultat.
De mest tidskrävande stegen involverar fysisk manipulation av biomassan. Slip prover kan ta flera minuter per prov, bland annat rensa kvarnen mellan prover. Manuellt lastning, lossning och rengöring trattar och påfyllning och tömning tepåsar och provpåsar är också mycket arbetskrävande. Även om varje steg kan ta en minut eller mer, kan göra tusentals prover ta många timmar eller dagar. Robotarna kan ladda en typisk reaktor platta med biomassa i cirka 3-4 timmar eller 6-8 plattor dag -1 robot -1. Denna situation beror på precisionsparametrar som används samt typen och mängden biomassa som ska testas. Fyllning reaktorplattor med vatten, utspädd syra, eller enzymet snabbt gjort med användning av en flytande robothantering. Pbehandling av en plattstapel (1 till 20 reaktorplattor) tar mellan 1 och 3 timmar när montering, svalna, och demontering ingår. Enzymhydrolys tar 3 dagar och analys sockret kräver ca 1 tim av prep tid plus 10 minuter per reaktorplattan för att slutföra analysen och läsa resultaten. Ett veckovis schema med som förbehandlings och analys dagar rymmer en rimlig arbetsschema, vilket minimerar udda timme och helg insatser för mänskliga komponenten i analysen och möjliggör bearbetning ~ 800 till 1.000 prover per vecka på ett löpande. Den maximala genomströmning beror på flera faktorer, främst hur mycket hårdvara (robotar, reaktorer tallrikar, etc.) och hur mycket "programvara" (dvs, bemanning) finns tillgängliga för att göra det manuellt arbete. Den praktiska övre gränsen är 2500 till 3000 sampel / vecka; kräver dock att utsignalen 7 dag i veckan drift och flera praktikanter och tekniker. I jämförelse skulle 3000 prover av HPLC kräver ca 125 dagar sampel analys plus extra arbetskraft manuellt väger prover i reaktorer och filtreringsprover före analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nyckelprovberedningssteg för att erhålla exakta och reproducerbara data när ledande high-throughput screening experiment är som följer:
Socker frisättningsanalys:
I allmänhet är prover i partier som sträcker sig från några tiotal till flera tusen i taget. Varje stort steg utförs typiskt för alla prover innan han flyttade framåt för att minimera variationer i beredningen mellan prover. De-stärkning var inte ursprungligen en del av protokollet och k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank intern Evelyn Von Neida who provided paramount insights regarding the preparation of biomass samples for both of the high-throughput pipelines discussed in this manuscript. Support for the development of this work and manuscript was provided by the BioEnergy Science Center. The BioEnergy Science Center is a U.S. Department of Energy Bioenergy Research Center supported by the Office of Biological and Environmental Research in the DOE Office of Science. The National Renewable Energy Laboratory (NREL) is a national laboratory of the US DOE Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, operated for DOE by the Alliance for Sustainable Energy, LLC. This work was supported by the U.S. Department of Energy under Contract No. DE-AC36-08-GO28308 with the National Renewable Energy Laboratory.
Materials
| Wiley mill | Thomas Scientific | 3375E15 (Model 4), or 3383L20 (Mini-mill) | ||
| anti-static bags | Minigrip* | MGST4P02503 | 2.5×3", multiple suppliers available | |
| tin-coated copper wire | McMaster-Carr | 8871K84 | 0.016" diameter, bend-and-stay wire | |
| tea-bags | Herbco | press n' brew teabags | 3.5×5 inches | |
| gluco-amylase | Novozymes | Spirizyme Fuel | ||
| alpha-amylase | Novozymes | Liquozyme SC DS | ||
|
any chemical supplier | reagent grade | ||
| acetic acid | any chemical supplier | reagent grade | ||
| 190 proof (95%) ethanol | any chemical supplier | reagent grade | ||
| hoppers | Freeslate | |||
| 96-well C-276 Hastelloy plates | Aspen Machining (Lafayette, Colorado) | N/A (custom built) | ||
| 1/8” soldering iron tip | Sears | |||
| silicone-adhesive backed Teflon tape | 3M | 5180 | 3" wide (36-yard rolls) | |
| enzyme solution | Novozymes | Cellic CTec2 | ||
| citric acid monohydrate | any chemical supplier | |||
| trisodium citrate dihydrate | any chemical supplier | |||
| disposable, polystyrene 96-well plates | Greiner Bio-One | 655101 | or equivalent; multiple suppliers available | |
| glucose oxidase/peroxidase | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose dehydrogenase | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| glucose standard solution | Megazyme | K-Gluc | Megazyme D-glucose assay kit | |
| xylose standard solution | Megazyme | K-Xylose | Megazyme D-xylose assay kit | |
| stainless steel sample cups | Frontier Laboratories | PY1-EC80F | ||
| glass fiber sheets | Pall | 66227 | 8×10" sheets–circles punched with standard hole punch | |
| Sugarcane Bagasse Whole Biomass Feedstock | NIST | 8491 | ||
| Eastern Cottonwood (poplar) Whole Biomass Feedstock | NIST | 8492 | ||
| Monterey Pine Whole Biomass Feedstock | NIST | 8493 | ||
| Wheat Straw Whole Biomass Feedstock | NIST | 8494 |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . U.S. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Henry, R. Ch. 5. Plant Resources for Food, Fuel and Conservation. , 53-80 (2009).
- Henry, R. J. Evaluation of plant biomass resources available for replacement of fossil oil. Plant Biotechnol. J. 8 (3), 288-293 (2010).
- Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnol. J. 12 (9), 1246-1258 (2014).
- Sluiter, J. B., Ruiz, R. O., Scarlata, C. J., Sluiter, A. D., Templeton, D. W. Compositional analysis of lignocellulosic feedstocks. 1. Review and description of methods. J. Agric. Food Chem. 58 (16), 9043-9053 (2010).
- Lupoi, J. S., Singh, S., Simmons, B. A., Henry, R. J. Assessment of Lignocellulosic Biomass Using Analytical Spectroscopy: an Evolution to High-Throughput Techniques. Bioenerg. Res. 7 (1), 1-23 (2014).
- Lapierre, C., Monties, B., Rolando, C. Thioacidolysis of lignin: comparison with acidolysis. J. Wood Chem. Technol. 5 (2), 277-292 (1985).
- DeMartini, J. D., Studer, M. H., Wyman, C. E. Small-scale and automatable high-throughput compositional analysis of biomass. Biotechnol. Bioeng. 108 (2), 306-312 (2010).
- Selig, M. J., et al. High throughput determination of glucan and xylan fractions in lignocelluloses. Biotechnol. Lett. 33 (5), 961-967 (2011).
- Selig, M. J., et al. Lignocellulose recalcitrance screening by integrated high-throughput hydrothermal pretreatment and enzymatic saccharification. Ind. Biotechnol. 6 (2), 104-111 (2010).
- Studer, M. H., De Martini, J. D., Brethauer, S., McKenzie, H. L., Wyman, C. E. Engineering of a high-throughput screening system to identify cellulosic biomass, pretreatments, and enzyme formulations that enhance sugar release. Biotechnol. Bioeng. 105 (2), 231-238 (2009).
- Gjersing, E., Happs, R. M., Sykes, R. W., Doeppke, C., Davis, M. F. Rapid determination of sugar content in biomass hydrolysates using nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 110 (3), 721-728 (2013).
- Templeton, D. W., Sluiter, A. D., Hayward, T. K., Hames, B. R., Thomas, S. R. Assessing corn stover composition and sources of variability via NIRS. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 621-639 (2009).
- Tucker, M. P., et al. Fourier transform infrared quantification of sugars in pretreated biomass liquors. Appl. Biochem. Biotechnol. 84-86, 39-50 (2000).
- Wolfrum, E. J., Sluiter, A. D. Improved multivariate calibration models for corn stover feedstock and dilute-acid pretreated corn stover. Cellulose (Dordrecht, Netherlands). 16 (4), 567-576 (2009).
- Ona, T., et al. Non-destructive determination of wood constituents by Fourier-transform Raman spectroscopy. J. Wood Chem. Technol. 17 (4), 399-417 (1997).
- Ona, T., Sonoda, T., Ohshima, J., Yokota, S., Yoshizawa, N. A rapid quantitative method to assess eucalyptus wood properties for kraft pulp production by FT-Raman spectroscopy. J. Pulp Pap. Sci. 29 (1), 6-10 (2003).
- Hames, B. R., Thomas, S. R., Sluiter, A. D., Roth, C. J., Templeton, D. W. Rapid biomass analysis. New tools for compositional analysis of corn stover feedstocks and process intermediates from ethanol production. Appl. Biochem. Biotechnol. 105-108, 5-16 (2003).
- Studer, M. H., et al. Lignin content in natural Populus variants affects sugar release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (15), 6300-6305 (2011).
- Chen, M., Zhao, J., Xia, L. Comparison of four different chemical pretreatments of corn stover for enhancing enzymatic digestibility. Biomass Bioenergy. 33 (10), 1381-1385 (2009).
- Davison, B. H., Drescher, S. R., Tuskan, G. A., Davis, M. F., Nghiem, N. P. Variation of S/G ratio and lignin content in a Populus. family influences the release of xylose by dilute acid hydrolysis. Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132, 427-435 (2006).
- Li, X., et al. Lignin monomer composition affects Arabidopsis cell-wall degradability after liquid hot water pretreatment. Biotechnol. Biofuels. 3, 27-33 (2010).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using multivariate analysis: a comparison between mid-infrared, near-infrared, and Raman spectroscopies for model development. Biotechnol. Biofuels. 7, 93 (2014).
- Lupoi, J. S., Smith, E. A. Characterization of woody and herbaceous biomasses lignin composition with 1064 nm dispersive multichannel Raman spectroscopy. Appl. Spectro. 66 (8), 903-910 (2012).
- Sun, L., et al. Rapid determination of syringyl:guaiacyl ratios using FT-Raman spectroscopy. Biotechnol. Bioeng. 109 (3), 647-656 (2012).
- Lupoi, J. S., et al. High-throughput prediction of Acacia and eucalypt lignin syringyl/guaiacyl content using FT-Raman spectroscopy and partial least squares modeling. Bioenerg. Res. in press, (2015).
- Sykes, R., Kodrzycki, B., Tuskan, G., Foutz, K., Davis, M. Within tree variability of lignin composition in Populus. Wood Sci. Technol. 42 (8), 649-661 (2008).
- Sykes, R., Mielenz, J. R., et al. Ch. 12. High-Throughput Screening of Plant Cell-Wall Composition Using Pyrolysis Molecular Beam Mass Spectroscopy. Biofuels: Methods and Protocols. 581, 169-183 (2009).
- Decker, S., Himmel, M. E., et al. Ch. 17. Reducing the effect of variable starch levels in biomass recalcitrance screening). Biomass Conversion. 908, 181-195 (2012).
- Evans, R. J., Milne, T. A. Molecular characterization of the pyrolysis of biomass. Energy Fuels. 1 (2), 123-137 (1987).
