Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

Resumen

Este manuscrito proporciona un procedimiento paso a paso para la derivación y el mantenimiento de queratinocitos humanos a partir de pelo arrancado y la posterior generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) libres de integración por vectores episomales.

Resumen

Los avances recientes en la reprogramación nos permiten convertir las células somáticas en células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSCs). El modelado de enfermedades mediante el uso de hiPSC específicas del paciente permite el estudio del mecanismo subyacente de la patogénesis, proporcionando también una plataforma para el desarrollo de la detección de fármacos in vitro y la terapia génica para mejorar las opciones de tratamiento. El prometedor potencial de las hiPSC para la medicina regenerativa también es evidente por el creciente número de publicaciones (>7000) sobre iPSCs en los últimos años. Varios tipos de células de distintos linajes se han utilizado con éxito para la generación de hiPSC, incluidos los fibroblastos de la piel, las células hematopoyéticas y los queratinocitos epidérmicos. Si bien las biopsias de piel y la extracción de sangre se realizan de forma rutinaria en muchos laboratorios como fuente de células somáticas para la generación de hiPSC, la recolección y posterior derivación de queratinocitos pilosos se utilizan con menos frecuencia. Los queratinocitos derivados del cabello representan un enfoque no invasivo para obtener muestras de células de los pacientes. Aquí describimos un método simple y no invasivo para la derivación de queratinocitos a partir de cabello arrancado. También proporcionamos instrucciones para el mantenimiento de los queratinocitos y su posterior reprogramación para generar hiPSC libres de integración utilizando vectores episomales.

Introducción

El descubrimiento de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) ha revolucionado el campo de la medicina regenerativa, proporcionando un método viable para la generación de células madre específicas del paciente ^1-3. hiPSCs se han generado con éxito de varios tipos de células somáticas, incluyendo fibroblastos, células hematopoyéticas ^{4,5 6,7,} células epiteliales renales de orina ⁸ y queratinocitos ^9,10. Hasta la fecha, los fibroblastos de piel y células hematopoyéticas representan las fuentes de células más comúnmente utilizados para la generación de CMPI específicos del paciente. Posiblemente, esto se debe....

Protocolo

La colección de la muestra de cabello humano de las personas requiere la aprobación ética por el comité de ética de la investigación humana en las instituciones de acogida y debe hacerse de conformidad con las directrices institucionales.

1. Aislamiento de queratinocitos de pelo Plucked

1. Descongele la matriz extracelular solución (ECM) (es decir, Matrigel) en el hielo O / N.
2. Utilizando puntas de pipeta de pre-enfriado, añadir 200 l solución ECM de 12 ml de medio DMEM / F12 frío. Rociar una placa de 12 pocillos con 1 ml de solución ECM diluido en cada pocillo. Incubar la placa recubierta O / N a 37 ° C. Lave la....

Resultados

El pelo pasa por 3 fases diferentes del ciclo de crecimiento: anágena (fase de crecimiento), catágena (la fase de regresión) y telógeno (la fase de descanso) ^20,21. El folículo del pelo anagen contiene múltiples capas de epitelio; estas capas incluyen las sales de rehidratación oral, IRS y el tallo del pelo (Figura 1). Anagen pelo finalmente se somete a la transición a la fase catágena, que se caracteriza por la apoptosis de las sales de rehidratación oral y la terminación de la diferenciació.......

Discusión

Generación de hiPSCs específicos del paciente ofrece un enfoque único para el estudio de la patogénesis en los tipos de células enfermas in vitro, y también proporciona una plataforma para la detección de drogas para identificar nuevas moléculas que pueden rescatar a los fenotipos de la enfermedad. Este enfoque de modelado enfermedad utilizando hiPSCs ha dado resultados prometedores para una variedad de enfermedades, incluyendo el síndrome de QT largo, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson y la escl.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de antibióticos:
de anfotericina B	Sigma	A2942-20 ml de 250 ng	/ml está compuesta por PBS.
1X Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
PBS (-)	Invitrogen	14190-144
Reemplazo de suero knockout (KSR) medio:			El medio KSR se filtra con Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) antes de su uso. El bFGF se añade fresco al medio antes de su uso.
20% de reemplazo de suero knockout (KSR)	Invitrogen	10828-028
DMEM/F12 con glutamax	Invitrogen	10565-042
1× MEM aminoácido no esencial	Invitrogen	11140-050
0.5 veces; Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
0,1 mM β-mercaptoetanol	Invitrogen	21985
bFGF (10 ng/ml, añadido fresco)	Millipore	GF003
Medio de queratinocito:
EpiLife con 60  y micro; M Invitrogen de calcio		M-EPI-500-CA
1× Suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (HKGS)	Invitrogen	S-001-5
Suero fetal bovino (FBS) medio:			El medio FBS se filtra con Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) antes de su uso.
10% suero fetal bovino (FBS)	Invitrogen	26140079
DMEM	Invitrogen	11995-073
0.5x Penicilina/Estreptomicina	Invitrogen	15140-122
2 mM L-glutamina	Invitrogen	25030
0.25% tripsina-EDTA	Invitrogen	25200-056
Matriz extracelular (ECM):
Matrigel	Corning	354234	Aliquot Matrigel stock y tienda en -80° C siguiente fabricante» s instrucciones. La concentración de existencias de Matrigel varía ligeramente de un lote a otro (~9 mg/ml). Recomendamos utilizar 200µ l Matrigel para recubrir una placa de 12 pocillos (~ 150 y micro; g/pozo).
Kit de matriz de recubrimiento	Invitrogen	R-011-K
Plásmidos:			Tenga en cuenta que pCXLE-eGFP solo se utiliza para monitorear la eficiencia de la transfección y no es necesario para la reprogramación.
-                  pCXLE-eGFP	Addgene	27082
-                  pCXLE-hOct3/4-shP53F	Addgene	27077
-                  pCXLE-hSK	Addgene	27078
-                  pCXLE-hUL	Addgene	27080
Reactivo de transfección Fugene HD	Promega	E231B
Gelatina (de piel de cerdo)	Sigma	G1890	Gelatina de composición al 0,1% en agua destilada. Autoclave antes de usar.
Medio sérico reducido: OPTI-MEM	Invitrogen	31985062
Accutase	Sigma	A6964-100ml
		fibroblastos embrionarios de ratón (MEF)	MEF puede ser inactivado por tratamiento con mitomicina C o irradiación como se ha descrito anteriormente 16.
Aguja de 26G	Terumo NN2613R
placa de 6 pocillos (tratamiento con cultivo de tejidos)	BD Biosciences	353046
placa de 12 pocillos (tratamiento con cultivo de tejidos)	BD Biosciences	353043
plato de 10 cm (tratamiento con cultivo de tejidos)	BD Biosciences
Dispasa	Invitrogen	17105-041	Uso a 10 mg/ml
Colagenasa IV	Invitrogen	17104-019	Uso a 1 mg/ml
Anticuerpo TRA-160	Millipore	MAB4360	Uso a 5 µ g/ml
anticuerpo OCT4	Santa Cruz	SC-5279	Uso a 5 µ g/ml
anticuerpo NANOG	R& D Systems	AF1997	Uso en 10 y micro; g/ml
Kit de detección MycoAlert	Lonza	LT07-418

La mezcla antibiótica Alimentador de 353003