The linear covalently closed (LCC) DNA minivector (DNA ministring) is a non-viral gene delivery vector offering high transfection efficiency and is relevant to any DNA delivery application. The production system is simple, rapid, and scalable in vivo. The following protocol provides visual step-by-step instructions for the production of DNA ministrings.
हम एक गैर-वायरल जीन-वितरण वेक्टर विकल्प विवो में एक साधारण मंच के माध्यम से उत्पादन के रूप में रेखीय covalently बंद (एलसीसी) डीएनए minivectors का निर्माण किया। डीएनए ministrings बढ़ सुरक्षा प्रोफ़ाइल के अधिकारी और भी कुशलता से लक्षित कोशिकाओं के डीएनए माल उद्धार। पारंपरिक डीएनए वैक्टर एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन, CPG रूपांकनों, और नकल के जीवाणु मूल, जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की उत्तेजना को जन्म दे सकती सहित अवांछनीय प्रोकार्योटिक दृश्यों, ले। पारंपरिक डीएनए वैक्टर की bioavailability भी उनके बड़े आणविक आकार की वजह से समझौता किया है। उनके परिपत्र प्रकृति भी इन्सर्शनल mutagenesis के लिए अग्रणी, गुणसूत्र एकीकरण प्रदान कर सकते हैं।
बैक्टीरियल दृश्यों डीएनए minivectors से excised हैं, केवल ब्याज (भारत सरकार) और आवश्यक यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति तत्वों के जीन को छोड़कर। हमारे एलसीसी डीएनए minivectors, या डीएनए ministrings, immunogenic बैक्टीरियल दृश्यों से रहित हैं; इसलिए वें सुधारEir जैव उपलब्धता और भारत सरकार अभिव्यक्ति। गुणसूत्र में वेक्टर एकीकरण की घटना में, एलसीसी डीएनए ministring घातक मेजबान गुणसूत्र को बाधित करेगा, जिससे proliferating सेल की आबादी से संभावित खतरनाक उत्परिवर्ती हटाने। नतीजतन, डीएनए ministrings 'minicircle' डीएनए का लाभ अवांछनीय वेक्टर एकीकरण की घटनाओं के लिए संभावित को नष्ट करते हुए प्रदान करते हैं। पारंपरिक plasmids और उनके isogenic परिपत्र covalently बंद (सीसीसी) समकक्षों की तुलना में, डीएनए ministrings बेहतर bioavailability, अभिकर्मक दक्षता, और cytoplasmic कैनेटीक्स का प्रदर्शन – वे इस प्रकार लक्ष्य कोशिकाओं के प्रभावी अभिकर्मक के लिए cationic surfactants की कम मात्रा की आवश्यकता होती है।
हम कोलाई में डीएनए ministrings का उत्पादन है कि प्रयोग करने में आसान है, तेजी से, और स्केलेबल है के लिए एक एक कदम विवो प्रणाली में inducible का निर्माण किया है।
लक्ष्य रेखीय covalently बंद (एलसीसी) डीएनए minivectors एक सरल और उच्च दक्षता के एक कदम गर्मी inducible इन विवो डीएनए ministring उत्पादन प्रणाली का उपयोग करने का स्केलेबल मात्रा में उत्पादन होता है। डीएनए ministrings एक सुरक्षित और प्रभावी गैर वायरल डीएनए रणनीति देने के लिए प्रदान करते हैं। वे डीएनए minicircles की दक्षता के साथ एलसीसी वैक्टर की सुरक्षा के गठबंधन, और भी अभिकर्मक दक्षता समझौता किए बिना वायरस व्युत्पन्न वैक्टर करने के लिए एक सुरक्षित विकल्प प्रदान करते हैं।
एक transgene वितरण प्रणाली के लिए आदेश में सफल होने के लिए, डीएनए वेक्टर लक्ष्य मेजबान कोशिका में प्रवेश और इनकोडिंग ट्रांस्जीन (ओं) व्यक्त करना चाहिए। वहाँ कई सेलुलर बाधाओं, व्यवहार में दूर करने की विशेष रूप से स्तनधारी सिस्टम में जरूरत है कि कर रहे हैं। आदेश reticulo-endothelial प्रणाली द्वारा सीरम न्युक्लिअसिज़ और प्रतिरक्षा पता लगाने के द्वारा गिरावट से बचने के लिए, डीएनए वेक्टर जैव और लक्ष्य प्रणाली के साथ प्रतिरक्षा-संगत होना चाहिए। असुरक्षित डीएनए जल्दी प्लाज्मा न्युक्लिअसिज़ से पच जाता हैऔर प्लाज्मिड झिल्ली घने लिपोप्रोटीन बाधाओं से बना है ताकि डीएनए वेक्टर तेजी से लक्ष्य कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली को पार करने में सक्षम होना चाहिए। सेल में एक बार, वैक्टर कोशिका द्रव्य पार और transgene अभिव्यक्ति के लिए नाभिक में प्रवेश करने के लिए परमाणु झिल्ली के माध्यम से पारित करना होगा। गैर-वायरल जीन डिलीवरी तकनीक ऊतक और सेल को निशाना बनाने की वृद्धि पर ध्यान केंद्रित। हालांकि, इन तकनीकों के साथ पारंपरिक plasmids के उपयोग immunogenic बैक्टीरियल दृश्यों की उपस्थिति है, जो तेजी से जीन अभिव्यक्ति 1,2 चुप्पी के कारण अभिकर्मक दक्षता कम कर देता है। परम्परागत plasmids आम तौर पर प्रोकार्योटिक प्रणालियों में रखरखाव के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों ले। हालांकि, इन मानव मेजबान टीम में संभावित प्रतिकूल प्रभाव उत्पादन या स्वाभाविक रूप से क्षैतिज जीन स्थानांतरण प्रभाव के माध्यम से मेजबान होने वाली वनस्पतियों के लिए प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं। परम्परागत plasmids भी डाईन्यूक्लियोटाइड सीपीजी रूपांकनों 2, जो एक अवांछित immunostimulatory प्रतिक्रिया ट्रिगर कर सकते हैं जिनमें संभावितकम करने या transgene अभिव्यक्ति मुंह बंद।
वे पूरी तरह से यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति कैसेट के शामिल कर रहे हैं, इस तरह के डीएनए minicircles 3 के रूप में डीएनए minivectors, उनके कम आकार और immunostimulatory प्रोकार्योटिक तत्वों के अभाव के कारण के रूप में वे बाह्य और intracellular जैव उपलब्धता और बेहतर जीन अभिव्यक्ति में सुधार एक्ज़िबिट जीन डिलीवरी के लिए एक बेहतर विकल्प हैं 4। कम हो वेक्टर आकार का किराया एक लक्ष्य साइट से 5 विवो प्रशासन के साथ जुड़े कतरनी बलों के प्रतिरोध के लिए सम्मान के साथ बेहतर है। इकाई बड़े पैमाने पर प्रति वेक्टर के उच्च प्रतिलिपि संख्या कम अभिकर्मक अभिकर्मक की आवश्यकता है, इस प्रकार विषाक्तता को कम करें। हालांकि, एक मेजबान गुणसूत्र में यादृच्छिक वेक्टर एकीकरण की घटना में, चक्राकार covalently बंद कर दोनों डीएनए minicircles और पारंपरिक plasmids सहित (सीसीसी) वैक्टर, आणविक निरंतरता प्रदान और इसलिए इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस, विनाशकारी परिणाम हो सकते हैं जो करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं <s> 6 अप। तुलनात्मक रूप से, एक रेखीय डीएनए वेक्टर के एकीकरण के गुणसूत्र बाधित और शुरू की कोशिका मृत्यु रास्ते, जिससे proliferating सेल की आबादी से उत्परिवर्ती सेल को दूर करने और इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस 7 को रोकने। न्यूनतर प्रतिरक्षा परिभाषित जीन अभिव्यक्ति (मिड्ज) वैक्टर 8 और सूक्ष्म रेखीय वैक्टर 9 (MiLV) इन विट्रो में विकसित एलसीसी डीएनए वैक्टर हैं। मिड्ज वैक्टर पारंपरिक प्लास्मिड डीएनए वैक्टर 11 की तुलना में विवो में एक 17 गुना सुधार किया transgene अभिव्यक्ति करने के लिए प्रदर्शन किया है, और टीका 10 और कैंसर 8 जीन थेरेपी में आशाजनक परिणाम का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, एलसीसी minivector की मरोड़ मुक्त संरचना के कारण, कम अभिकर्मक अभिकर्मक सीसीसी supercoiled समकक्ष की तुलना में आवश्यक है, इस प्रकार की विषाक्तता 7 को कम करने।
हमारी बढ़ाया एलसीसी डीएनए वैक्टर, डीएनए ministrings, बेहतर अभिव्यक्ति क्षमता और bioavai दिखा दिया हैlability 7। इसके अलावा, डीएनए ministrings एक एक कदम गर्मी inducible इन विवो उत्पादन प्रणाली, मिड्ज और MiLV एलसीसी वैक्टर, जो इन विट्रो में कई कदम की आवश्यकता के लिए एक समीचीन और लागत प्रभावी विकल्प पर उत्पादित कर रहे हैं। डीएनए ministring उत्पादन प्रणाली का प्रदर्शन किया जा करने के लिए एक सरल गर्मी inducible प्रक्रिया विवो में प्रदर्शन किया, जिससे यह है दोनों लागत प्रभावी और आसानी से स्केलेबल। इस प्रणाली Yersinia enterocolitica जीवाणुभोजी PY54 व्युत्पन्न तेल / पाल पुनर्संयोजन प्रणाली 12 protelomerase प्रोकार्योटिक प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी से कम से कम यूकेरियोटिक अभिव्यक्ति कैसेट को अलग करने का लाभ उठाते। हम कोलाई कोशिकाओं (W3NN) गर्मी inducible जीवाणुभोजी λ प्रमोटर, सीआई [टी] 857 13 के नियंत्रण में तेल protelomerase व्यक्त करने के लिए इंजीनियर है। अभिव्यक्ति पर, तेल protelomerase "सुपर अनुक्रम" (एसएस) अग्रदूत प्लाज्मिड पर स्थित साइटों के भीतर मौजूद पाल लक्ष्य साइटों पर काम करता हैएलसीसी उत्पादों, जिसमें से डीएनए ministring तो शुद्ध किया जा सकता है (चित्रा 1) उपज के लिए। डीएनए ministring अग्रदूत प्लाज्मिड पर एसएस साइटों को भी, Cre recombinase (Lox), TelN protelomerase (telRL) और FLP recombinase (FRT) सहित अन्य recombinases के लिए लक्षित साइटों सांकेतिक शब्दों में बदलना जिससे एक अग्रदूत प्लाज्मिड से isogenic एलसीसी और सीसीसी minivectors के उत्पादन की सुविधा। इसके अलावा, प्रत्येक एसएस साइट SV40 बढ़ाने (SV40e) दृश्यों, जो परमाणु translocation 14 में सुधार करने के लिए सेवा द्वारा दोनों पक्षों पर घिरे हुए है। हम कहीं और दिखा दिया कि SV40e की लगातार इसके उत्तरोत्तर अभिकर्मक दक्षता 7 में इसी बढ़ जाती है प्रदान की है। अग्रदूत प्लाज्मिड (pDNA MiniString या PDMS) एक polylinker (चित्रा 1) हरी फ्लोरोसेंट रिपोर्टर (GFP) के साथ ट्रांसक्रिप्शनल संलयन में ब्याज की किसी भी वांछित जीन की प्रविष्टि की सुविधा के लिए होता है।
डीएनए प्रौद्योगिकी मई minivectorजीन स्थानांतरण, संवाददाता जीनों की अभिव्यक्ति, और यूकेरियोटिक प्रणालियों में transgene अभिव्यक्ति की दक्षता की दिशा में आकलन के लिए पारंपरिक तरीकों के स्थान पर प्रयोग किया। डीएनए ministrings biocompatibility और बढ़ रैखिक डीएनए वैक्टर की बेहतर सुरक्षा के प्रोफाइल के साथ "मिनी" वैक्टर अभिकर्मक दक्षता लाभ गठबंधन। हमारे मजबूत एक कदम उत्पादन मंच तेजी से और आसानी से किसी भी जीन स्थानांतरण आवेदन के लिए डीएनए ministrings पैदा करता है और एक उच्च सुरक्षा प्रोफाइल प्रदान करता है।
हम यहाँ एक एक कदम गर्मी inducible प्रोटोकॉल है, जो कि जो ठेठ बैक्टीरिया विकास और हेरफेर में प्रयोग किया जाता है एक तरफ से कोई विशेष उपकरणों की आवश्यकता का उपयोग कर एलसीसी डीएनए ministrings के उत्पादन के लिए एक सरल प्रणाली का वर्णन है। डीएनए ministrings मरोड़ मुक्त, स्थिर रैखिक डीएनए अभिव्यक्ति कैसेट, प्रोकार्योटिक आनुवंशिक तत्वों से रहित हैं। वे जीन स्थानांतरण, संवाददाता जीनों की अभिव्यक्ति है, साथ ही में यूकेरियोटिक प्रणालियों में transgene अभिव्यक्ति की दक्षता की दिशा में आकलन के लिए पारंपरिक तरीकों के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है। डीएनए ministrings biocompatibility और बढ़ रैखिक डीएनए वैक्टर की बेहतर सुरक्षा के प्रोफाइल के साथ "मिनी" वैक्टर अभिकर्मक दक्षता लाभ गठबंधन। विवो उत्पादन मंच में हमारे मजबूत एक कदम तेजी से और आसानी से कई महंगा प्रक्रियाओं में इन विट्रो के लिए आवश्यकता के बिना किसी भी जीन स्थानांतरण आवेदन के लिए डीएनए ministrings पैदा करता है।
वहाँ करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैंइष्टतम ministring उत्पादन (आंकड़े 2 और 3) किया जाता है। गर्मी प्रेरण उत्पादन ministring करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है। उत्पादन ministring के पूर्ण अभाव गर्मी प्रेरण (30 डिग्री सेल्सियस पर बरकरार रखा कोशिकाओं), जहां protelomerase अभिव्यक्ति के दमन एलसीसी ministring के अग्रदूत प्लाज्मिड के रूपांतरण को रोकता की कमी के कारण सबसे अधिक संभावना है। गर्मी प्रेरण प्रोटोकॉल के बाद, लगभग 75% की उत्पादन क्षमता की उम्मीद है। जबकि कोशिकाओं लॉग चरण में हैं गर्मी प्रेरण इष्टतम है। हालांकि पीई ministring जब ( "ऊंचा हो गया", चित्रा 3) स्थिर चरण में कोशिकाओं का प्रयोग करने में कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर नहीं है, हम समग्र प्लाज्मिड उपज में लगभग एक 50% कमी का निरीक्षण किया था। पैदावार प्लाज्मिड निकासी इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल पर निर्भर करेगा। इष्टतम ministring उत्पादन के लिए, गर्मी प्रेरण को गति प्रदान करते हुए कोशिकाओं लॉग चरण में हैं। गरीब ministring उत्पादन की संभावना सबसे अधिक लंबे समय तक तापमान Upshift या insufficie का परिणाम हो जाएगाNT तापमान downshift। इस सक्रिय हो जाता है के रूप में लंबे समय तक ई तापमान Upshift हतोत्साहित किया जाता है कोलाई गर्मी झटका प्रतिक्रिया 15 है, जो protelomerase गतिविधि को बाधित और प्लाज्मिड स्थिरता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसलिए, समय तापमान downshift कुशल ministring उत्पादन के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम है। 30 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त ऊष्मायन समय के बिना, ministring उत्पादन क्षमता में बहुत गरीब हो ( "प्रारंभिक निकालना", चित्रा 3) मिला था। इस तेल की अभिव्यक्ति और गतिविधि के लिए आवश्यक समय की राशि के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। प्रारंभिक prophage PY54 एन्कोडिंग तेल protelomerase सामान्य रूप से Yersinia, जो बेहतर, लगभग 28 डिग्री सेल्सियस 12 बढ़ता है यह दर्शाता है कि 30 डिग्री सेल्सियस से भी तेल गतिविधि के लिए अधिक इष्टतम हो सकता है संक्रमित।
डीएनए minivector उत्पादन प्रणाली के एक विवो मंच उच्च गुणवत्ता वाले जीवाणु से मुक्त अनुक्रम डीएनए minivectors उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल करता है। प्रोटोकॉल में संशोधन मैं मईविकास मीडिया में फेरबदल के क्रम में विकास के चरण के दौरान सेल के विकास (पौंड की बजाय टीबी) को बढ़ावा देने, या उत्पादन और रूपांतरण दक्षता ministring बढ़ाने के लिए प्लाज्मिड और प्रोटीन के उत्पादन का अनुकूलन करने के nclude। बड़े संस्कृति मात्रा में (200 मिलीलीटर और अधिक से अधिक), तापमान downshift और 30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के लिए पीई ministring पर गंभीर नकारात्मक प्रभाव के बिना रात भर बढ़ाया जा सकता है। हम एक उदाहरण के रूप में 500 मिलीलीटर संस्कृतियों के लिए हमारे प्रोटोकॉल में संशोधनों को शामिल किया है। डीएनए ministrings की शुद्धि प्रोकार्योटिक रीढ़ की इन विट्रो endonuclease पाचन के माध्यम से तेजी लाई जा सकती है। Endonuclease लक्ष्य साइटों की एक नंबर रहे हैं (उदाहरण के लिए, पीआई-SCEI, PvuI, ScaI) अग्रदूत प्लाज्मिड, जो खुले रेखीय बेनकाब करने के लिए काटा जा सकता है की प्रोकार्योटिक रीढ़ की हड्डी पर उपलब्ध है, समाप्त हो जाती है प्रोकार्योटिक रीढ़ की इन विट्रो गिरावट के लिए अनुमति देता है। अन्य वेक्टर प्रजातियों से ministrings के अलगाव भी आयनों विनिमय झिल्ली क्रोमैटोग्राफी 16 के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है।
एक मौजूदा एलसीसी डीएनए वेक्टर उत्पादन प्रणाली के साथ जुड़े अन्य सीमा एलसीसी और सीसीसी उत्पादों से डीएनए ministring की शुद्धि के लिए की जरूरत है। हालांकि आसानी से मानक प्लाज्मिड अलगाव तरीकों का उपयोग कर शुद्ध, अलगाव कदम अभी भी एक बड़े पैमाने पर स्थापित करने में एक नुकसान हो सकता है। ministring के पृथक्करण समय लेने वाली उम्र का उपयोग कर यदि ministring और एलसीसी प्रोकार्योटिक रीढ़ की हड्डी के आकार में भी इसी तरह के हैं हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, आयनों विनिमय झिल्ली क्रोमैटोग्राफी सीसीसी वेक्टर प्रजातियों 16 से ministrings के बेहतर जुदाई प्रदान कर सकता है। तापमान Upshift एक और संभावित सीमा हो सकती है के रूप में उच्च तापमान भी ई में गर्मी झटका प्रतिक्रिया सक्रिय कोलाई, जो नकारात्मक पुनः संयोजक प्रोटीन को प्रभावित करता है और फलस्वरूप 17 पैदावार रूपांतरण ministring को प्लाज्मिड की दरों को कम। हम कहीं और रिपोर्ट उत्पादन मंच का अनुकूलन दरकिनार और / या गर्मी झटका 18 के इस तरह के प्रभाव को कम करने के लिए। हमवर्तमान में भी खत्म करने या विवो में एलसीसी प्रोकार्योटिक रीढ़ प्रदूषण को कम करने के तरीकों अनुकूलित कर रहे हैं।
एलसीसी डीएनए ministring के गुणसूत्र एकीकरण मेजबान गुणसूत्र बाधित और apoptosis के लिए सेल विषयों। इतना ही नहीं इस तरह के oncogenesis और आसन्न जीन का मुंह बंद, जिससे इसकी सुरक्षा में सुधार के रूप में इन्सर्शनल mutagenesis के संभावित नकारात्मक परिणामों को कम करता है; घातक प्रभाव भी जुड़े दुष्प्रभाव और एकीकरण की क्षति के बिना तोड़े और जीन प्रतिस्थापन के अध्ययन के लिए एक आदर्श तरीका के रूप में काम कर सकते हैं। डीएनए ministring वैक्टर विवो में हस्तांतरण और एक निश्चित लक्ष्य में चिकित्सीय प्रोटीन, आरएनए, एंटीबॉडी, या एंटीजन के लिए जीनों की अभिव्यक्ति की दिशा में लागू या एक mal- या गैर कार्यात्मक एलील की जगह किया जा सकता है। सरल एक कदम गर्मी inducible इन विवो उत्पादन प्रणाली डीएनए ministring वैक्टर आसानी से नैदानिक या औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए उत्पादन किया जा करने की अनुमति देता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस काम के वित्तपोषण के लिए प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा () NSERC के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल धन्यवाद।
E. coli W3NN | Mediphage | strain for ministring processing: Nafissi & Slavcev, 2012 | |
pDMS.IRES.GFP | Mediphage | parent plasmid for ministring processing: also referred to as pDNA Ministring (pDMS) | |
BD™ Difco™ Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | 244620 | |
Fisher BioReagents™ Terrific Broth | Fisher Scientific | BP2468500 | |
BD™ Bacto™ Dehydrated Agar | Fisher Scientific | 214010 | |
Ampicilin | MP Biomedicals LCC | 2190147 | |
Ultrapure Milipore Water | Fisher Scientific | Z00Q0V0US | Model: Mili-Q Advantage A10 Water Purification System |
Surgical Gloves | VWR | (S) 82026-424, (M)82026-426, (L) 82026-428, (XL) 82026-430 | |
Fisherbrand™ Petri Dishes with Clear Lid Raised Ridge (100 x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
30 mL KIMAX® Test Tubes | VWR | 89001-448 | |
Spectrophotometer Cuvette | Sarstedt | 67.74 | |
Sterile 15 mL Falcon Tubes | BD Falcon | 62406-200, | |
Sterile 50 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 2930-S0 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 10 mL | BD Falcon | 13-675-20 | |
Falcon™ Disposable Polystyrene Serological Pipets 25 mL | BD Falcon | 13-668-2 | |
Micropipettor (100-1000 μL) | FroggaBio | C1000-1 | |
Micropipettor (20-200 μL) | FroggaBio | C200-1 | |
Sterile Pipette Tips (100-1250 μL) | VWR | 89079-472 | |
Sterile Pipette Tips (1-200 μL) | VWR | 89079-460 | |
Fisher Scientific Economy Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | M1352-00000 | |
Sterile Erlenmeyer Flask (125 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980125 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (250 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980250 Aldrich | |
Sterile Erlenmeyer Flask (500 mL) | Pyrex (Sigma Aldrich) | CLS4980500 Aldrich | |
Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 335901 | Model: Genesys 10 Vis |
Floor Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | Model: Avanti J-E |
Benchtop Centrifuge | Beckman | 362114 | Model: GS-6R |
Fisher Scientific Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-365 | |
1 kb DNA Ladder | New England BioLabs | N3232S |