Оценка чувствительности и Perigenital простаты тучных клеток активации в мышиной модели новорожденных материнской разъединении

Summary

Мы измеряем активации perigenital механическую чувствительность и тучных клеток в простате у мужчин C57BL / 6 мышей, которые прошли в начале жизни стресс парадигму – новорожденных материнской разделения, для того, чтобы индуцировать доклинические модель простатита / синдрома хронической тазовой боли хронической.

Abstract

Хронический простатит / синдром хронической тазовой боли (CP / ПКЮТО) имеет распространенность 14% жизни, и является наиболее распространенным урологическим диагнозом для мужчин моложе 50, но это наименее понятных и учился хронической тазовой боли расстройства. Существенное число пациентов с хронической тазовой боли доклада пережив стресс раннего жизни или злоупотребления, которые могут заметно повлиять на функционирование и регулирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (HPA) оси. Активация тучных клеток, который, как было показано, чтобы быть увеличена в моче и выражены секрета простаты СР пациентов / КППС, частично регулируется вниз по течению активации оси HPA. Неонатальный материнской разделение (НМС) была использована для более чем двух десятилетий, чтобы изучить результаты раннего стресса жизни в моделях грызунов, в том числе изменения в оси HPA и висцеральной чувствительности. Здесь мы предлагаем подробный протокол для использования NMS в доклинической модели CP / ПКЮТО у самцов мышей C57BL / 6. Мы описываем методологиюдля выполнения NMS, оценки perigenital механической аллодинии и гистологические признаки активации тучных клеток. Мы также предоставляем доказательства того, что в начале психологический стресс может иметь долгосрочные последствия на мужской мочеполовой системы у мышей.

Introduction

Хроническая тазовая боль сама по себе не болезнь, а скорее термин, связанный с продолжающимся спонтанным и / или вызывал боли, испытываемой пациентами с диагнозом синдром раздраженного кишечника (СРК), цистит / синдром болезненного мочевого пузыря интерстициальной (IC / PBS), вульводиния, или хронический простатит / синдром хронической тазовой боли (CP / ПКЮТО). Эти синдромы часто сопутствуют и имеют много общих характеристик, что у них нет сопутствующей патологии или выявила основные этиологии, хотя дисфункция в иммунной системе, центральной нервной системы, и периферической нервной системы, как было показано содействовать поддержанию и прогрессирования этих нарушений ^{1 -3.} Пациенты с хронической тазовой болью, скорее всего, представит с симптомами, не входящим в тазовой связанных функциональных расстройств боли и расстройства настроения, в том числе тревоги, депрессии и панического расстройства ^4-6, который был связан с изменением функционирования гипоталамо гипофизарнонадпочечников (HPA) оси ^7-10. Воздействие стресса начале жизни или травмы значительным фактором риска для развития гПа нарушения и связанные с ними хронические болевые синдромы ^10,11 и, как таковой, значительная группа пациентов с функциональными расстройствами тазовых боли сообщают, что испытали негативные события детства, такие как злоупотребления или пренебрежения ^12-14.

Грызунов модели новорожденных материнской разделения (NMS), которая включает в себя удаление щенков от их плотины в течение установленного периода времени, в течение периода preweaning, были использованы в течение последних двух десятилетий, чтобы изучить результаты раннего стресса жизни. В общем, НМС, как было показано, чтобы увеличить HPA оси активации, и, как следствие тревоги, как поведение, непосредственно влияет на экспрессию генов в гипоталамусе, а также нарушения ниже по потоку от регулирования лимбических структурах ^15-18. Нарушение нормального функционирования гПа оси, как было показано способствовать увеличению прямой кишки ^19-22 </sup> И вагинальный ¹⁶ Чувствительность отображается моделей грызунов NMS, но, несмотря на обширный характеристики долгосрочного эффекта послеродового воспаления мочевого пузыря ^23-25, влияние стресса начале жизни в значительной степени пошли неизученным в мочеполовых органах. Таким образом, следующие исследования опишу, как выполнять NMS в мышей, а затем оценить perigenital механическую чувствительность и тучных клеток инфильтрации / активацию в простате, чтобы проверить использование мужских NMS мышей в доклинической модели для CP / СХТБ.

Из всех диагностированных хронических тазовых болевых расстройств, CP / ПКЮТО, пожалуй, не менее хорошо признаны и характеризуется синдром, несмотря на то, что распространенность жизни примерно на 14% ²⁶ и ежегодные расходы пациента на сумму $ 4,400 (в два раза, что боли в пояснице или ревматоидный артрит ^27). Пациенты с CP / CPPS отчета боли в промежности, прямой кишки, предстательной железы, полового члена, яичек и / или живот ^28, опыт приветGher степень психологического стресса, чем пациентов контрольной ²⁹ и обычно присутствует с симптомами или с диагнозом сопутствующих хронической тазовой боли или расстройства настроения ^5,29-31. Периодические инфекции, вытекающей эпителий, нейрогенного воспаления, и аутоиммунные все были предположил в качестве потенциальных основных причин CP / КППС ^2,32,33, а также активации тучных клеток и дегрануляции ^34. Выраженные простаты выделениями из мужчин с CP / ПКЮТО возросло тучных клеток триптазы и фактора роста нервов (ФРН) уровни ³⁴ и более позднее исследование подтвердило, что триптазой и карбоксипептидазы А (CPA3), маркер активации тучных клеток, также увеличилось в Моча больных СР / КППС ^35. Потенциальная роль тучных клеток в начале и поддержания СР / СХТБ была основным направлением исследований на животных на этой синдрома до сих пор. Наиболее часто используется модель с грызунами используется для изучения CP / ПКЮТО является экспериментальный аутоиммунный простатит (EAP) модель поколениясоздававшие путем подкожной инъекции антигена простаты в полном адъюванте Фрейнда, что приводит к различным степеням железы воспаления в зависимости от вида и штамма используемых ^34,36-39. Мачты инфильтрация и активация / дегрануляции было показано, чтобы увеличить следующий индукцию EAP ^34,35,40. Трансгенные мыши с дефицитом либо в тучных клетках ³⁴ или триптазы рецептора par2 ³⁵ не развиваются железы тактика чувствительность следующий EAP, в отличие от дикого типа EAP мышей. Хотя это доклинические модель воспроизводит многие из характеристик человеческого CP / СХТБ, протокол индукции не является признаком состояния человека, который имеет различной этиологии и часто не связаны напрямую воспаление, инфекции, травмы или предстательной железы.

Влияние стресса начале жизни на развитие CP / СХТБ у людей в основном пропали неизученными; Однако, исследование Ху и др. ^41, показали, что мнеп, которые сообщили истории детства физического, эмоционального и / или сексуальное насилие значительно чаще испытывают симптомы, указывающие на CP / СХТБ. Кроме того, они показали, что боль и мочевыводящих оценки были повышены у пациентов с историей физического и эмоционального насилия. Ранее мы показали, что та же НМС парадигма в женской мышей C57BL / 6 производит влагалищное гиперчувствительность и аномальной экспрессии генов в обоих влагалища и мочевого пузыря наводит на мысль о неблагополучных HPA выхода оси ^16. Это свидетельство в сочетании с высокой распространенностью CP / пациентов КППС представляющих с другими сопутствующими заболеваниями, в том числе ⁴² IC / PBS и расстройств настроения, которые более четко было показано, что связано с ранней жизни стресс воздействия ^12-14, обеспечивает обоснование использования НМС модель для исследования CP / СПП у мышей.

Protocol

Все эксперименты, описанные в этом протоколе соответствует руководящим принципам NIH в соответствии с руководящими принципами, указанными в Университете Канзаса медицинский центр Уходу за животными и использованию комитета. 1. новорожденных матери Разделение (НМС) <l…

Representative Results

Мыши, которые прошли НМС показали поведенческие доказательства, указывающего CP / СХТБ. При тестировании с градуированной серии фон Фрея мононити, 8-недельных мышей NMS (п = 4) отображается perigenital механической аллодинии, когда по сравнению с наивных коллег (п = 5, рис 2). Об этом свидет?…

Discussion

Этот протокол обеспечивает методологию для использования у новорожденных стресс, в форме NMS, чтобы вызвать симптоматику, указывающую CP / ПКЮТО в взрослых самцов мышей. Как взрослые, НМС мыши обнаруживают значительное perigenital механической аллодинии, а также доказательства дегрануляции т…

Materials

Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 mL
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.