Évaluation de la sensibilité et de la prostate péri-Mast Cell Activation dans un modèle murin de la séparation maternelle néonatale

Summary

Nous mesurons activation périgénitale mécanique de la sensibilité et des mastocytes dans la prostate des hommes C57BL / 6 qui a subi un début de paradigme du stress de la vie – la séparation maternelle néonatale, afin d'induire un modèle préclinique de syndrome chronique de la prostatite chronique / de douleurs pelviennes.

Abstract

La prostatite chronique / syndrome de la douleur pelvienne chronique (CP / CPPS) a une prévalence à vie de 14% et est le diagnostic urologique la plus courante pour les hommes de moins de 50 ans, mais il est le trouble le moins bien compris et a étudié la douleur pelvienne chronique. Un sous-ensemble significatif de patients avec le rapport de la douleur pelvienne chronique ayant connu le stress de début de la vie ou d'abus, ce qui peut sensiblement affecter le fonctionnement et la régulation du (HPA) axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien. L'activation des mastocytes, qui a été montré à être augmentée dans l'urine et exprimé sécrétions prostatiques de patients CP / CPPS, est partiellement régulée par activation en aval de l'axe HPA. La séparation maternelle néonatale (NMS) a été utilisé pendant plus de deux décennies à étudier les résultats de début de stress de la vie dans les modèles de rongeurs, y compris les changements dans l'axe HPA et la sensibilité viscérale. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'utilisation de NMS comme un modèle préclinique de CP / CPPS dans C57BL / 6 souris mâles. Nous décrivons la méthodologiepour effectuer NMS, évaluer allodynie mécanique périgénitale, et la preuve histologique de l'activation des mastocytes. Nous fournissons également des preuves que le stress psychologique précoce peut avoir des effets à long terme sur le système génito-urinaire masculin chez la souris.

Introduction

La douleur pelvienne chronique est pas en soi une maladie, mais plutôt un terme associé à la douleur continue spontanée et / ou évoquée vécue par les patients diagnostiqués avec le syndrome du côlon irritable (IBS), la cystite interstitielle / syndrome de la vessie douloureuse (IC / PBS), vulvodynie, ou le syndrome de douleur pelvienne prostatite chronique / chronique (CP / CPPS). Ces syndromes sont souvent des comorbidités et partagent beaucoup de caractéristiques en ce qu'ils présentent aucune pathologie associée ou étiologie identifiée, bien que a été montré un dysfonctionnement dans le système immunitaire, le système nerveux central et le système nerveux périphérique de contribuer à l'entretien et à la progression de ces troubles ^{1 -3.} Les patients souffrant de douleurs pelviennes chroniques sont plus susceptibles de présenter des symptômes de plus, non-pelvienne liée à des troubles fonctionnels de la douleur et des troubles de l'humeur, y compris l'anxiété, la dépression et le trouble panique ^4-6, qui a été associée avec le fonctionnement altéré de la hypothalamo hypophysosurrénalien (HHS) ^7-10. L'exposition au stress de la vie au début ou à un traumatisme est un facteur de risque important pour le développement des anomalies HPA et les syndromes de douleur chronique associée ^10,11 et, comme tel, un sous-ensemble significatif de patients atteints de troubles de douleur pelvienne fonctionnels ont indiqué avoir vécu les événements de l'enfance indésirables tels que l'abus ou la négligence ^12-14.

des modèles de rongeurs de la séparation maternelle néonatale (SMN), qui consiste à enlever les chiots de leur mère pour une période de temps au cours de la période d'avant le sevrage, ont été utilisées pour les deux dernières décennies pour étudier les résultats de début de stress de la vie. En général, NMS a été montré pour augmenter l'activation de l'axe HPA, et les comportements de type anxieux qui en résultent, en affectant directement l'expression des gènes dans l'hypothalamus, ainsi que de perturber la régulation en aval de structures limbiques ^15-18. Perturbation du bon fonctionnement de l'axe HHS a été montré pour contribuer à l'augmentation colorectal ^19-22 </sup> Vaginale et ¹⁶ sensibilité affichée par les modèles de NMS de rongeurs, mais malgré une caractérisation de l'effet à long terme de ^23-25 ​​postnatale inflammation de la vessie, de l'impact de début stress de la vie a largement pas été étudié dans les organes génito-urinaires. Par conséquent, l'étude suivante décrira comment effectuer NMS chez les souris et plus tard d'évaluer la sensibilité mécanique périgénitale et l'infiltration des mastocytes / activation dans la prostate pour valider l'utilisation de souris mâles NMS comme un modèle préclinique pour CP / CPPS.

De tous les troubles diagnostiqués de douleurs pelviennes chroniques, CP / CPPS est peut-être le syndrome de moins bien reconnu et caractérisé, en dépit d'une prévalence à vie d'environ 14% ²⁶ et les coûts annuels de patients estimés à $ 4400 (deux fois celle de la lombalgie ou la polyarthrite retour l'arthrite ^27). Les patients atteints de CP / CPPS rapport douleurs au niveau du périnée, du rectum, de la prostate, pénis, testicules, et / ou à l'abdomen ^28, l'expérience d'un salutgher degré de stress psychologique que les patients témoins ^29, et couramment présente avec des symptômes de ou sont diagnostiqués avec la douleur ou les troubles de l'humeur pelviennes chroniques concomitantes ^5,29-31. Infection récurrente, l'épithélium qui fuit, une inflammation neurogène, et l'auto-immunité ont tous été supposé que les causes sous-jacentes potentielles de CP / CPPS ^2,32,33, ainsi que l'activation des mastocytes et la dégranulation ^34. Sécrétions prostatiques exprimé à partir d'hommes atteints de CP / CPPS avaient augmenté tryptase des mastocytes et le facteur de croissance des nerfs (NGF) niveaux ^34, et une étude plus récente confirme que la tryptase et la carboxypeptidase A (CPA3), un marqueur de l'activation des mastocytes, ont également été augmenté dans le urine de patients CP / CPPS ^35. Le rôle potentiel des mastocytes dans l'apparition et le maintien de CP / CPPS a été une préoccupation majeure de la recherche animale sur ce syndrome jusqu'ici. Le modèle de rongeur le plus couramment employé utilisé pour étudier CP / CPPS est une prostatite auto-immune expérimentale (PAE) modèle gensurvoltage par injection sous-cutanée de l'antigène de la prostate dans de l'adjuvant complet de Freund, qui se traduit par des degrés variés de l'inflammation de la prostate selon l'espèce et la souche utilisée ^34,36-39. Il a été démontré infiltration de cellules de mât et l'activation / dégranulation à augmenter après l'induction de l'EAP ^34,35,40. Les souris transgéniques déficientes en soit mastocytes ³⁴ ou le récepteur PAR2 tryptase ³⁵ ne développent pas la sensibilité de la prostate tactique suivante EAP, contrairement aux souris de type sauvage du PAE. Bien que ce modèle préclinique reproduit bon nombre des caractéristiques de CP humaine / CPPS, le protocole d'induction ne sont pas indicatifs de la condition humaine, qui a une étiologie diverse et souvent ne comporte pas l'inflammation directe, une infection ou une blessure de la prostate.

L'influence de début stress de la vie sur le développement de CP / CPPS chez les humains est largement passée objet d'aucune enquête; Toutefois, une étude menée par Hu et al. ^41, a démontré que moin qui ont rapporté une histoire de physique de l'enfance, émotionnel, et / ou d'abus sexuels étaient beaucoup plus susceptibles d'éprouver des symptômes évocateurs d'CP / CPPS. En outre, ils ont montré que la douleur et les scores urinaires ont été augmentées chez les patients ayant des antécédents de violence physique et psychologique. Nous avons précédemment démontré que le même paradigme dans NMS femelle C57BL / 6 souris produit une hypersensibilité vaginal et l'expression du gène anormal à la fois dans le vagin et la vessie suggestif de sortie de l'axe HPA ¹⁶ dysfonctionnelle. Cette preuve combiné avec la forte prévalence de CP / CPPS patients présentant des comorbidités ⁴² autres, y compris les IC / PBS et troubles de l'humeur, qui ont été présentées plus clairement être lié à la vie tôt le stress exposition ^12-14, fournit la justification de l'utilisation d'un NMS modèle d'enquêter CP / CPPS chez la souris.

Protocol

Toutes les expériences décrites dans ce protocole sont conformes aux directives du NIH en conformité avec les orientations définies par l'Université du Kansas Medical Center Institutional Animal Care et l'utilisation Comité. 1. Séparation néonatale maternelle (NMS) Surveiller barrages enceintes quotidienne pour les naissances de litière. Remarque: Le jour de la litière est né est considéré P0. Sur P1, enlever le barrage de la cage de la maison…

Representative Results

Les souris qui ont subi NMS a montré des preuves de comportement indicatif de CP / CPPS. Lors d'un essai avec une série graduée de monofilaments von Frey, souris NMS 8 semaines-vieux (n = 4) affiché allodynie mécanique périgénitale par rapport à leurs homologues naïfs (n = 5, figure 2). Ceci est démontré qu'une réduction significative (p <0,01; test t de Student) dans le seuil de retrait mécanique qui a suscité une réaction positive des comportements, enregistrée comm…

Discussion

Ce protocole fournit une méthodologie pour utiliser le stress néonatal, sous la forme de NMS, pour induire une symptomatologie indicatif de CP / CPPS chez les souris mâles adultes. Comme les adultes, les souris NEM affichent allodynie mécanique périgénitale importante, ainsi que la preuve de la dégranulation des mastocytes dans le tissu de la prostate. L'utilisation de NMS est une nouvelle approche pour développer un modèle préclinique de CP / CPPS en ce qu'elle reproduit le stress de la vie au début …

Materials

Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 mL
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.