Vurdering af Perigenital Følsomhed og prostata mastcelleaktivering i en musemodel for Neonatal Maternal Separation

Summary

Vi måler perigenital mekanisk følsomhed og mastcelleaktivering i prostata af C57BL / 6 mus, der undergik en tidlig liv stress paradigme – neonatal maternal separation, for at inducere en præklinisk model af kronisk prostatitis / kronisk bækkensmerter syndrom.

Abstract

Kronisk prostatitis / kronisk bækkensmerter syndrom (CP / CPP'er) har en levetid prævalens på 14% og er den mest almindelige urologisk diagnose for mænd under 50 år, men det er det mindste forstået og studerede kroniske bækkensmerter lidelse. En væsentlig undergruppe af patienter med kroniske bækkensmerter rapport have oplevet tidligt i livet stress eller misbrug, som kan påvirke markant funktion og regulering af hypothalamus-hypofyse-binyre (HPA) aksen. Mastcelleaktivering, hvilket har vist sig at blive forøget i både urin og udtrykt prostatasecerneringer af CP / CPP patienter, er delvist reguleret af nedstrøms aktivering af HPA-aksen. Neonatal maternal separation (NMS) er blevet anvendt i mere end to årtier at studere resultaterne af tidlige liv stress i gnavermodeller, herunder ændringer i HPA-aksen og visceral følsomhed. Her giver vi en detaljeret protokol for brug af NMS som en præklinisk model af CP / CPP'er hos mandlige C57BL / 6 mus. Vi beskriver metodentil udførelse af NMS, vurderer perigenital mekanisk allodyni og histologiske tegn på mastcelleaktivering. Vi tilbyder også dokumentation for, at tidlig psykologisk stress kan have langvarige effekter på den mandlige urogenitale system hos mus.

Introduction

Kroniske bækkensmerter ikke i sig selv en sygdom, men snarere en sigt er forbundet med den igangværende spontan og / eller fremkaldt smerte oplevet af patienter diagnosticeret med irritabel tarmsyndrom (IBS), interstitiel cystitis / smertefuld blære syndrom (IC / PBS), vulvodynia, eller kronisk prostatitis / kroniske bækkensmerter syndrom (CP / CPP). Disse syndromer er ofte komorbide og deler mange egenskaber i at de ikke har tilknyttet patologi eller identificeret underliggende ætiologi, selv er blevet vist dysfunktion i immunsystemet, centralnervesystemet, og det perifere nervesystem til at bidrage til vedligeholdelse og progression af disse lidelser ^{1 -3.} Patienter med kroniske bækkensmerter er mere tilbøjelige til at præsentere med symptomer på yderligere, ikke-bækken-relaterede funktionelle smertelidelser og affektive lidelser, herunder angst, depression og panikangst ^4-6, som er blevet associeret med ændret funktion af hypothalamus- hypofyseadrenal (HPA) aksen ^7-10. Udsættelse for tidlige liv stress eller traumer er en væsentlig risikofaktor for udvikling af HPA abnormiteter og tilhørende kroniske smerter syndromer ^10,11, og som sådan, rapporterer en betydelig undergruppe af patienter med funktionelle Bækkensmerter lidelser har oplevet negative barndomsoplevelser begivenheder såsom misbrug eller forsømmelse ^12-14.

Gnaver modeller af neonatal maternal separation (NMS), som indebærer fjernelse af hvalpe fra deres mor for en fastsat periode i løbet af før fravænning periode, er blevet brugt til de sidste to årtier til at studere resultaterne af tidlige liv stress. Generelt har NMS vist sig at øge HPA-akse-aktivering, og resulterende angst-lignende adfærd, ved direkte at påvirke genekspression i hypothalamus, samt forstyrrer nedstrøms regulering fra limbiske strukturer ^15-18. Afbrydelse af korrekt HPA akse funktion har vist sig at bidrage til øget kolorektal ^19-22 </sup> Og vaginal ¹⁶ følsomhed vises af gnaver NMS modeller, men trods omfattende karakterisering af den langsigtede effekt af postnatal blære betændelse ^23-25, har effekten af tidlige liv stress stort set gået unstudied i urogenitale organer. Derfor vil følgende undersøgelse beskriver, hvordan du udfører NMS i mus og senere evaluere perigenital mekanisk følsomhed og mast celle infiltration / aktivering i prostata for at validere brugen af ​​mandlige NMS mus som en præklinisk model for CP / CPP'er.

Af alle de diagnosticerede kroniske bækkensmerter lidelser, CP / CPP'er er måske den mindst velkendt og karakteriseret syndrom, trods en langtidsprævalens på ca. 14% ²⁶ og årlige patient omkostninger anslås til $ 4400 (det dobbelte af lændesmerter eller rheumatoid arthritis ^27). Patienter med CP / CPP rapport smerter i mellemkødet, rektum, prostata, penis, testikler, og / eller maven ^28, opleve en hiGher grad af psykologisk stress end kontrolpatienter ^29, og almindeligt til stede med symptomer på eller er diagnosticeret med komorbide kroniske bækkensmerter eller humørsvingninger ^5,29-31. Tilbagevendende infektion, utætte epitel, neurogen inflammation, og autoimmunitet er alle blevet formodet som potentielle underliggende årsager til CP / CPP ^2,32,33 samt mastcelleaktivering og degranulering ^34. Udtrykte prostatasecerneringer fra mænd med CP / CPP var steget mastcelletryptase og nervevækstfaktor (NGF) niveauer ^34, og en senere undersøgelse bekræftede, at tryptase og carboxypeptidase A (CPA3), en markør for mastcelleaktivering, blev også forøget i urin fra CP / CPP patienter ^35. Den potentielle rolle for mastceller i indtræden og opretholdelse af CP / CPP har været et stort fokus for animalsk forskning på dette syndrom hidtil. Den mest almindeligt anvendte gnaver-model anvendes til at undersøge CP / CPP er en eksperimentel autoimmun prostatitis (EAP) model genbejdede ved subkutan injektion af prostata antigen i Freunds komplette adjuvans, hvilket resulterer i forskellige grader af prostata inflammation afhængig af art og stamme anvendes ^34,36-39. Mast celle infiltration og aktivering / degranulation har vist sig at stige efter induktion af EAP ^34,35,40. Transgene mus mangler enten mastceller ³⁴ eller tryptase receptor PAR2 ³⁵ ikke udvikler prostata taktik følsomhed efter EAP modsætning vildtype EAP mus. Mens dette prækliniske model replikerer mange af de særlige kendetegn ved den menneskelige CP / CPP'er, induktion protokollen er ikke udtryk for den menneskelige tilstand, som har en varieret ætiologi og ofte involverer ikke direkte inflammation, infektion eller skade af prostata.

Indflydelsen af ​​tidlige liv stress på udvikling af CP / CPP hos mennesker er stort set gået ikke undersøgt; Men en undersøgelse fra Hu, et al. ^41, viste, at mign som rapporterede en historie af barndommen fysiske, følelsesmæssige og / eller seksuelle overgreb var signifikant mere tilbøjelige til at opleve symptomer på CP / CPP'er. De viste desuden, at både smerte og urinveje scoringer blev øget hos patienter med en historie af fysisk og følelsesmæssig misbrug. Vi har tidligere vist, at den samme NMS paradigme i kvindelig C57BL / 6 mus producerer vaginal overfølsomhed og unormal genekspression i både vagina og blære antyder dysfunktionel HPA-akse-udgang ^16. Dette beviser kombineret med den høje forekomst af CP / CPP'er patienter med andre co-morbiditet ^42, herunder IC / PBS og humørsvingninger, der er mere tydeligt vist sig at være forbundet med tidlige liv stress eksponering ^12-14, giver rationalet for at bruge en NMS model til at undersøge CP / CPP i mus.

Protocol

Alle forsøg er beskrevet i denne protokol i overensstemmelse med NIH retningslinjer i overensstemmelse med de retningslinjer, der er angivet af University of Kansas Medical Center Institutional Animal Care og brug Udvalg. 1. Neonatal Maternal Separation (NMS) Overvåg gravide moderdyr dagligt for strøelse fødsler. Bemærk: Den dag kuldet er født anses P0. På P1, fjerne dæmningen fra hjemmet bur og anbringes i en ren sekundær beholder. Gnid en hån…

Representative Results

Mus, der har undergået NMS viste adfærdsmæssige beviser indikerer CP / CPP. Når det testes med en gradueret serie af von Frey-monofilamenter, 8 uger gamle NMS mus (n = 4) vises perigenital mekanisk allodyni sammenlignet med naive modstykker (n = 5, figur 2). Dette fremgår som en signifikant reduktion (p <0,01; t-test) i den mekaniske tilbagetrækningstærskel der fremkaldte en positiv adfærdsmæssig reaktion, registreres som en rask ryk eller hoppe som reaktion på monofilament ansøgn…

Discussion

Denne protokol giver metode til at bruge neonatal stress, i form af NMS, at fremkalde symptomologi tegn på CP / CPP'er i voksne hanmus. Som voksne, de NMS mus viser betydelig perigenital mekanisk allodyni, samt bevis for mastcelledegranulering i prostata væv. Brugen af NMS er en ny tilgang til at udvikle en præklinisk model af CP / CPP ved, at den gentager det tidlige liv stress, der ofte rapporteret af patienter med kroniske bækkensmerter ^12-14, samt inkorporering af et ikke-invasiv induktion, som mo…

Materials

Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 mL
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 mL Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.