डिजिटल बूंद पीसीआर Formalin तय आयल एम्बेडेड निर्देश मानक सेल लाइनों में BRAF V600E उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए रोजगार
Summary
इस वीडियो के लक्ष्य के लिए एक नैदानिक सेटिंग में दुर्लभ म्यूटेशन का पता लगाने के लिए formalin तय आयल एम्बेडेड (FFPE) संदर्भ मानक सेल लाइनों और डिजिटल छोटी बूंद पीसीआर (ddPCR) विश्लेषण से स्वचालित डीएनए निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन करने के लिए है। FFPE नमूनों में म्यूटेशन का पता लगाने के FFPE नमूनों में ddPCR के नैदानिक उपयोगिता को दर्शाता है।
Abstract
ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.
Introduction
कुंजी नियामक जीन में आनुवंशिक परिवर्तन के संचय कैंसर 1 के लिए अग्रणी, सेल प्रसार, भेदभाव, और अस्तित्व की तरह सामान्य कोशिका प्रोग्रामिंग बदल। आरएएस-आरएएफ-एमएपी काइनेज मार्ग विकास संकेतों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता करता है। ऑन्कोजेनिक BRAF म्यूटेशन 2 अति बनने के लिए oncoprotein BRAF कारण हो सकता है जो BRAF जीन में म्यूटेशन ड्राइवर, से परिणाम कर सकते हैं। BRAF जीन में उत्परिवर्तन भी बारी में, वृद्धि कारक की मध्यस्थता विनियमन 4-6 की स्वतंत्र रूप से अत्यधिक सेल के विकास और प्रसार के लिए होता है, जो खल्क और ERK 3, के माध्यम से अति बहाव के संकेत में परिणाम।
कई उपकरण ऐसे ddPCR द्वारा formalin तय, आयल एम्बेडेड (FFPE) संदर्भ मानक सेल लाइनों में मात्रात्मक वास्तविक समय BRAF V600E म्यूटेशन के रूप में, डीएनए उत्परिवर्तन की रूपरेखा के लिए उपलब्ध हैं। ddPCR पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए एक पीसीआर आधारित विधि हैपारंपरिक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) 7.8 की तुलना में अधिक सटीकता की पेशकश की। ddPCR भी अधिक सूचनात्मक कैंसर अनुसंधान और निदान 9 सक्षम करने, डीएनए टेम्पलेट्स में दुर्लभ म्यूटेशन का पता लगाने के लिए शक्ति और सटीकता को हल करने में अधिक प्रदान करता है। कम टेम्पलेट प्रतिलिपि संख्या 10-12 का अध्ययन करते समय पारंपरिक qPCR खत्म ddPCR का अतिरिक्त लाभ अपने बढ़ाया संवेदनशीलता और सटीकता शामिल हैं। इस के साथ साथ, स्वचालित रूप से ddPCR द्वारा BRAF V600E म्यूटेशन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के द्वारा पीछा FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों, से डीएनए निकालने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया है। डेटा विश्लेषण और परिणामों की एक चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग भी वर्णित हैं। पूरी प्रक्रिया अपेक्षाकृत आसान है और पूरी तरह से प्रोफाइल किए गए नमूनों की संख्या और उपलब्ध पारंपरिक पीसीआर और ddPCR मशीनों की संख्या पर निर्भर करता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल BR के लिए मानक प्रक्रियाओं का वर्णन वायुसेना V600E पॉजिटिव FFPE संदर्भ मानक सेल लाइनों (HD598, HD593, HD617, HD273 और wildtype (डब्ल्यूटी)) ऊतक तैयार करने की प्रणाली (टीपीएस) प्रोटोकॉल का उपयोग एक पूरी तरह से स्वचालित उपकरण में किया जाता है। बाद में, पृथक डीएनए नमूने ddPCR प्रणाली का उपयोग कर BRAF V600E म्यूटेशन की उपस्थिति के लिए विश्लेषण कर रहे हैं। सभी नमूनों profiled गया है के बाद लक्षित उत्परिवर्तन विश्लेषण किया जाता है और डेटा डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में लोड कर दिया गया है। नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है / समूहों का अध्ययन किया, डेटा विश्लेषण एक से कई घंटे के लिए आवश्यकता हो सकती है। कार्यप्रणाली की प्रयोगात्मक घटक निपटने में सटीकता की आवश्यकता डीएनए औरrological pipettes और Pipettors, pipetting के संदर्भ के बारे में के बारे में अधिक समझा एक जौव विज्ञान शिक्षा वीडियो "> 96 प्लेटों में pipetting, डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एक विशेष जीन उत्परिवर्तन मूल्यांकन के लिए FFPE संदर्भ मानक सेल लाइन के नमूनों से ddPCR की प्रयोज्यता और डीएनए अलगाव पर प्रकाश डाला। इस अध्ययन में, टीपीएस स्वचालित डीएनए अलगाव विधि आसानी से, स्वचालित…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध विज्ञान, सूचना और संचार प्रौद्योगिकी और भविष्य योजना (अनुदान सं 2013M3C8A1075908) मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के समाज के लिए अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (एनआरएफ) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument | Siemens | 10701001 | Automated DNA isolation instrument |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 772BR1119 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 771BR1497 | |
| Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment | 621BR17718 | ||
| PX1 PCR plate sealer | Bio-Rad | 770BR1575 | |
| QuantaSoft software | Bio-Rad | ||
| DNA isolation kit | |||
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632398 | |
| VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1 | Siemens | 10632399 | |
| CO-RE tips | Siemens | ||
| ddPCR mutation analysis | |||
| ddPCR Supermix | Bio-Rad | BR186-3010 | 2X concentration |
| DG8 cartridge | Bio-Rad | BR186-4008 | |
| Droplet Generator oil | Bio-Rad | BR-186-3005 | |
| Gasket | Bio-Rad | BR186-3006 | |
| Droplet reader oil | Bio-Rad | BR-186-3004 |
References
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