Electroporation और रासायनिक अभिकर्मक उपचार के लिए चिकन भ्रूण से पूरे रेटिना explants
Summary
इस प्रोटोकॉल, काटना प्रयोगात्मक हेरफेर और चिकन भ्रूण से संस्कृति पूरे रेटिना explants के लिए एक विधि का वर्णन है। उच्च सफलता दर, प्रभावकारिता और reproducibility electroporation और / या अभिकर्मक पदार्थ, यानी, एंजाइमी अवरोधकों के लिए plasmids के प्रभाव का परीक्षण करने की जरूरत है जब explant संस्कृतियों उपयोगी होते हैं।
Abstract
रेटिना के विकास के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए एक अच्छा मॉडल है। ओवो / इन विवो में प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के लिए आंख के बड़े आकार और सबसे महत्वपूर्ण बात पहुंच चिकन भ्रूण रेटिना एक बहुमुखी और बहुत ही कुशल प्रयोगात्मक मॉडल बनाता है। चिकन रेटिना intraocular इंजेक्शन या electroporation द्वारा ओवो में लक्षित करना आसान है, रेटिना के भीतर अभिकर्मकों के प्रभावी और सटीक एकाग्रता पूरी तरह से नियंत्रण करने के लिए मुश्किल हो सकता है। यह आंख या पदार्थों का असमान प्रसार से सटीक इंजेक्शन साइट, रिसाव की विविधताओं के कारण हो सकता है। इसके अलावा, इस तरह के इलेक्ट्रोपोरेशन के रूप में आक्रामक जोड़तोड़ के बाद विकृतियों और मृत्यु दर की आवृत्ति बल्कि उच्च है।
इस प्रोटोकॉल चिकन भ्रूण से पूरे रेटिना explants संवर्धन के लिए तकनीक ओवो एक पूर्व वर्णन करता है और अभिकर्मकों के लिए रेटिना के नियंत्रित तक पहुंचाने के लिए एक तरीका प्रदान करता है। आद्यकर्नल प्रयोगात्मक, काटना हेरफेर, और चिकन भ्रूण से संस्कृति पूरे रेटिना explants करने के लिए कैसे करें। explants लगभग 24 घंटे के लिए संवर्धित किया जा सकता है और इस तरह इलेक्ट्रोपोरेशन के रूप में विभिन्न जोड़तोड़ के अधीन हो। प्रमुख लाभ प्रयोग भ्रूण के अस्तित्व पर और शुरू की अभिकर्मक की एकाग्रता विविध और प्रभावी एकाग्रता का निर्धारण और अनुकूलन करने के क्रम में नियंत्रित किया जा सकता है कि निर्भर नहीं है कि कर रहे हैं। इसके अलावा, तकनीक इसकी उच्च प्रयोगात्मक सफलता दर के साथ एक साथ, तेजी से सस्ता और है, यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने को सुनिश्चित करता है परिणाम है। ऐसा लगता है कि ओवो में प्रदर्शन प्रयोगों के लिए एक उत्कृष्ट पूरक के रूप में कार्य करता है कि जोर दिया जाना चाहिए।
Introduction
रेटिना केंद्रीय तंत्रिका तंत्र का हिस्सा है और यह उसके रिश्तेदार सादगी और अच्छी तरह से विशेषता सेलुलर वास्तुकला, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विकास के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल के साथ है। चिकन भ्रूण की आंख भ्रूण के बाकी की तुलना में अपेक्षाकृत बड़ी है। इसलिए यह इस तरह के इंजेक्शन या electroporation के रूप में प्रयोगात्मक जोड़तोड़, के लिए ओवो में आसानी से सुलभ है, और रेटिना सेल और vivo में विकास जीव विज्ञान के बारे में ज्ञान हासिल करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण के रूप में कार्य करता है। प्रयोगों electroporations दोहराया, इंजेक्शन, या संयुक्त प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के साथ ही इस तरह के आक्रामक रहे हैं जब इन बड़े फायदे के बावजूद, भ्रूण के अस्तित्व कम हो सकता है।
ओवो में चिकन भ्रूण में डीएनए plasmids के electroporation एक महत्वपूर्ण और अच्छी तरह से स्थापित तकनीक 1 है। यह केंद्रीय nerv में सेल भाग्य के साथ-साथ न्यूरोनल इलाकों की ट्रेसिंग, न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए अनुमति देता हैous प्रणाली और यह विवो में प्रोटीन समारोह का विश्लेषण करने के लिए अस्थानिक जीन अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है। तकनीक 3 hindbrain, और 4 रेटिना, न्यूरल ट्यूब 2 की पढ़ाई के लिए इस्तेमाल किया गया है। ओवो में भ्रूण रेटिना के electroporation vivo स्थिति से संबंधित हैं जो कुछ प्रयोगात्मक कठिनाइयों है। भ्रूण के कपाल तह के कारण आंख की स्थिति, दिल के लिए अपेक्षाकृत करीब है। इस निकटता इलेक्ट्रोपोरेशन निम्नलिखित हृदय की गिरफ्तारी का खतरा है, और भ्रूण की उम्र के साथ जोखिम बढ़ जाती है बढ़ जाती है। इसके अलावा, आंख का उपयोग करने के लिए है, यह है, जिससे खून बह रहा है, विकृतियों और बाद में कम हो व्यवहार्यता के लिए खतरा बढ़ रही है, भ्रूण झिल्ली को खोलने के लिए आवश्यक है। परीक्षण और एक ज्ञात प्ररूपी परिणाम के बिना अक्सर एक नई डीएनए प्लाज्मिड जब अनुकूलन, इन सीमाओं भी एक अनुभवी प्रयोगवादी के लिए विधि की प्रभावकारिता और शक्ति कम हो सकती है। इस प्रोटोकॉल, w की संस्कृति के रूप में पेशहटा दिया वर्णक उपकला के साथ पूरे तंत्रिका रेटिना के रूप में परिभाषित छेद रेटिना explant, ओवो दृष्टिकोण में पूरक है कि एक कारगर तरीका है।
रासायनिक अभिकर्मकों के intraocular इंजेक्शन ओवो में प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं। हालांकि, तंत्रिका रेटिना के भीतर इंजेक्शन अभिकर्मकों के प्रभावी और सटीक एकाग्रता पूरी तरह से नियंत्रित करने के लिए मुश्किल हो सकता है। इंजेक्शन की मात्रा रिसाव के कारण भिन्न हो सकते हैं और इंजेक्शन की सटीक साइट आंख के भीतर अभिकर्मक के वितरण और कांच का शरीर के माध्यम से प्रसार दोनों को प्रभावित कर सकता है। परिवर्तनशीलता यानी, एक एंजाइम अवरोध करनेवाला के लिए एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र चुना गया है जब परिणामों की व्याख्या के लिए प्रमुख प्रभाव होगा; प्रभाव छोटा है और प्रभाव के अस्थायी खिड़की संकीर्ण है, खासकर अगर। ओवो प्रयोगों में प्रदर्शन कर इसके अलावा, जब केवल एक ही आंख की वजह से रक्त प्रवाह के माध्यम से संभावित प्रणालीगत प्रभाव के लिए प्रत्येक भ्रूण से इस्तेमाल किया जा सकताcontralateral आंख पर। विकास और इलाज और नियंत्रण भ्रूण अतिरिक्त प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के बीच व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता का अध्ययन करते समय उम्र मिलान महत्वपूर्ण है।
इन कारणों के लिए, चिकन भ्रूण से रेटिना explants पर आधारित पद्धति ओवो एक पूर्व में जो तंत्रिका रेटिना एक समान करने के लिए अवगत कराया जा सकता है और इन विट्रो में प्रयोगात्मक हालत नियंत्रित, विकसित किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल पिछले प्रोटोकॉल 5-9 के आधार पर विकसित किया गया था। मंच से रेटिना explants (अनुसूचित जनजाति) st31 करने के लिए 20 (3 भ्रूण दिन [ई]) (E7) चिकन भ्रूण सुसंस्कृत, विच्छेदित और electroporated एक परिभाषित डीएनए प्लाज्मिड एकाग्रता के साथ या एक रासायनिक अभिकर्मक के एक परिभाषित एकाग्रता युक्त एक माध्यम से अवगत कराया गया। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक ऐसी KU55933, एस.बी. 218,078, और एनएससी 109,555 dito के रूप में डीएनए की क्षति मार्ग के नियामकों, सहित कई विभिन्न रासायनिक अभिकर्मकों का उपयोग, हाल के प्रकाशनों में लागू किया गया हैऐसे Cdk1 / 2 अवरोध करनेवाला तृतीय 10,11 के रूप में sylate, और सेल चक्र,।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस काम में विच्छेदन, electroporation या रासायनिक उपचार, और चिकन भ्रूण से पूरे रेटिना explants के संवर्धन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। इस प्रोटोकॉल त्वरित, आसान है और दोनों एक उच्च सफलता दर और प्रतिलिप…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond and St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
Materials
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10xDPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm Petri dish | VWR | 734-0006 | |
| 100 μL pipette tips | VWR | 613-0798 | |
| 1.5 mL disposable plastic cuvette | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| 24-well plate | Sigma Aldrich | D7039 | |
| 35 mm Petri dish | VWR | 391-1998 | |
| 70% ethanol | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inhibitor III | 217714 | Calbiochem | 300nM in 0.01% DMSO |
| Cell culture incubator | Thermo Forma | ||
| Dissecting microscope | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Electrodes | Platina, custom made | ||
| Electro square porator ECM 830 | Harvard Apparatus | ||
| F12 Nutrient mix | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Forceps | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Freezing medium NEG50 | Cellab, Sweden | 6502 | |
| GFP expressing DNA plasmid (pZGs) | |||
| Humidified incubator | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany | 8204 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030024 | |
| Mounting medium ProLong Gold with DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Paraffin film | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way embedding mold | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillin streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| PhosphoHistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Dilution 1/4000 |
| Platinum electrodes (custom made from "rondelles") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Dia: 4mm, 0.1 mm thickness |
| Platimun electrodes | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Polyethylene pasteur pipette | VWR | 612-2853 | |
| Rotator shaker | VWR | 444-2900 | |
| Small spoon | VWR | 231-2151 | |
| Sucrose | VWR | 443815S | |
| White Leghorn eggs | Local supplier | ||
| Wine cooler | WineMaster 24, Caso, Berlin Germany |
References
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