Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
रोधगलन (एमआई) शारीरिक और व्यवहार के स्तर पर नाटकीय मध्य और दीर्घकालिक परिणाम है, लेकिन शामिल तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं कर रहे हैं। हमारी प्रयोगशाला बिगड़ा हृदय कार्य, लिम्बिक सिस्टम में neuronal नुकसान, संज्ञानात्मक घाटे और अवसाद के व्यवहार संकेत प्रदर्शित करता है कि बाद एमआई सिंड्रोम का एक चूहे मॉडल विकसित किया है। बाद एमआई 3 दिन में बढ़ता जा – न्यूरोनल स्तर पर, कस्पासे 3 सक्रियण ऐसे प्रमस्तिष्कखंड के रूप में विभिन्न लिम्बिक क्षेत्रों में बाद एमआई एपोप्टोसिस मध्यस्थता करता है। संज्ञानात्मक व्यवहार और दोष 2-3 सप्ताह के बाद एमआई दिखाई देते हैं और इन कस्पासे 3 गतिविधि के उपायों के साथ सांख्यिकीय रूप सहसंबंधी। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, एमआई प्रेरित प्रमस्तिष्कखंड ऊतक को इकट्ठा करने और spectrofluorometry का उपयोग कर कस्पासे 3 गतिविधि को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। एमआई के लिए प्रेरित करने के लिए, उतरते कोरोनरी धमनी में 40 मिनट के लिए occluded है। चूहों बलिदान कर रहे हैं और प्रमस्तिष्कखंड rapi पृथक: कस्पासे 3 सक्रियण के मूल्यांकन के लिए प्रोटोकॉल 3 दिन एमआई के बाद शुरू होता हैमस्तिष्क से Dly। नमूने जल्दी से तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हैं और वास्तविक विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। कस्पासे 3 सक्रियण का आकलन करने के लिए किया तकनीक spectrofluorometry से मापा जा सकता है कि एक fluorogenic यौगिक विज्ञप्ति जो कस्पासे 3 से एक सब्सट्रेट (DEVD-एएमसी) की दरार पर आधारित है। कार्यप्रणाली मात्रात्मक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, लेकिन आवश्यक उपकरण महंगा है और नमूने बढ़ाता के लिए प्रक्रिया समय लेने वाली है। इस तकनीक जैसे हृदय और गुर्दे के रूप में अन्य ऊतकों के लिए लागू किया जा सकता है। DEVD-एएमसी अन्य कास्पासेस की गतिविधि को मापने के लिए अन्य substrates द्वारा बदला जा सकता है।
Caspases या Cysteine निर्भर aspartate निर्देशित प्रोटिएजों विभिन्न समस्थिति processess 1 में शामिल कर रहे हैं कि एंजाइमों के एक परिवार के हैं। Caspases मोटे तौर पर apoptosis या सूजन में उनकी भूमिकाओं के अनुसार वर्गीकृत किया जा सकता है। कस्पासे -1, -4, -5 और -12 एपोप्टोसिस में लगे लोगों के हो सकते हैं, जबकि सूजन में शामिल कर रहे उप-वर्गीकृत सर्जक कास्पासेस के रूप में (कस्पासे 8 और -9) और जल्लाद caspases (कस्पासे 3, -6 और -7 )।
रोधगलन (एमआई) या मस्तिष्क ischemia के बाद मनाया के रूप में caspases, मुख्य रूप से एपोप्टोसिस अत्यधिक हो सकता है, जहां विकारों में, कई विकृतियों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल के बाद एमआई सिंड्रोम के चूहे मॉडल में, यह कस्पासे 3 मायोकार्डियम 2 में भी, लेकिन मूड और भावनाओं को 3-6 के नियंत्रण में फंसा है जो लिम्बिक सिस्टम में न केवल सक्रिय हो जाता है कि स्थापित है। यह भी कस्पासे 3 अलग-अलग क्षेत्रों में सक्रिय है देखा गया है किलिम्बिक सिस्टम की, इस तरह के प्रमस्तिष्कखंड और हिप्पोकैम्पस, और इस्कीमिक अपमान 4 के बाद 3 दिन के आसपास इस सक्रियण चोटियों के रूप में। दिलचस्प बात यह है कस्पासे 3 गतिविधि के बाद एमआई व्यवहार impairments के साथ संबद्ध है, और औषधीय और पोषण हस्तक्षेप के माध्यम से अपने क्षीणन कस्पासे 3 और बाद एमआई अवसाद 7-12 के बीच एक संभव लिंक का सुझाव दे, इन चोटों को कम करता है।
कस्पासे 3 सक्रियण विभिन्न तकनीकों से मापा जा सकता है। पश्चिमी सोख्ता कास्पासेस के enzymatic गुण ascertains और सक्रिय एंजाइमों के साथ ही उनके समर्थक एंजाइम रूपों पता लगा सकते हैं। पश्चिमी सोख्ता, तथापि, अर्द्ध मात्रात्मक है, और छोटे बदलाव कमजोर संकेत करने वाली शोर अनुपात 13 के माध्यम से खो दिया जा सकता है। एक बेहतर तकनीक एक fluorogenic यौगिक जारी है और spectrofluorometry से मापा जा सकता है कि कस्पासे 3 से एक सब्सट्रेट (DEVD-एएमसी) की दरार पर आधारित है। कस्पासे 3 सक्रियण apoptosis की एक विश्वसनीय मार्कर है। एपोप्टोसिस सीए के मापनएन घटना के समय खिड़की कम है, क्योंकि अस्थिर हो सकता है, और पड़ोसी कोशिकाओं apoptotic निकायों या 14 कोशिकाओं का भक्षण कर सकता है। Apoptosis आगे इस तरह Bax / रूप apoptotic cascades संकेत 6, या विरोधी apoptotic / समर्थक प्रोटीन के अनुपात से उत्पन्न डीएनए विखंडन का पता लगाता है कि इस तरह के टर्मिनल deoxynucleotidyl ट्रांस्फ़्रेज़ dUTP निक अंत लेबलिंग (TUNEL) परख के रूप में अन्य तकनीकों के द्वारा पुष्टि की जा सकती Bcl2 6।
पिछले 10 वर्षों में इस प्रोटोकॉल के साथ हमारा अनुभव महत्वपूर्ण methodological मुद्दों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया। सबसे पहले, कुचल बर्फ पर एक पेट्री डिश में तेजी से मस्तिष्क विच्छेदन तैयारी की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, यह ऊतक sonication के अन्य ऐसे दिल (10 सेकंड) के रूप में ऊतकों के प्रकार, या गुर्दे (20 सेकंड) की तुलना में मस्तिष्क प्रमस्तिष्कखंड के लिए कम है कि एहसास होना चाहिए। तीसरा, महान देखभाल ध्यान से नमूनों में जोड़ने से पहले सब्सट्रेट मिश्रण करने के लिए लिया जाना चाहिए। मिश्रण अनुक्रम अपर्याप्त था जब हम चर संकेतों का सामना करना पड़ा। नमूने जब पढ़ने चौथा, कोई बुलबुले क्वार्ट्ज सेल में मौजूद होना चाहिए। अन्यथा, संकेत बदला जा सकता है।
1 μl की तुलना में कम मात्रा से बचने के लिए सब्सट्रेट मात्रा बढ़ रही है: हम परिणामों के reproducibility बढ़ाने के लिए पिछले कुछ वर्षों में एक परिवर्तन किया है। फिर भी, छोटे बदलाव लगातार assays के बीच हो सकता है, और कम से कम 3 नियंत्रण के नमूने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएबदलाव के लिए नियंत्रण। इन पर नियंत्रण के प्रतिदीप्ति उपायों औसत रहे हैं और मतलब 100% पर सेट किया जाता है। प्रयोगात्मक नमूनों में प्रतिदीप्ति उपायों नियंत्रण के नमूने के प्रतिशत में तब्दील कर रहे हैं।
तकनीक की एक और सीमा इसलिए, कस्पासे 3 गतिविधि को कम करके आंका जा सकता है, ऊतक के केवल एक हिस्से का इस्तेमाल किया जाता है और। दरअसल, apoptosis के समय खिड़की किसी भी कोशिका में कम है और यह 1,4,15 नमूने के समय आसपास के इलाकों में होता है, भले ही याद किया जा सकता है। उलटा भी संभव है: एपोप्टोसिस कस्पासे 3 गतिविधि की overestimation, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक के कुछ भागों में विशेष रूप से तीव्र हो सकता है। हम इस तरह के TUNEL assays या Bax / Bcl2 अनुपात (परिचय देखें) के रूप में पूरक तकनीक, के लिए शेष ऊतकों (प्रमस्तिष्कखंड) के उपयोग की सलाह देते हैं।
Spectrofluorometry पश्चिमी सोख्ता के ऊपर कम से कम दो फायदे हैं। सबसे पहले, यह सीधे मात्रात्मक डेटा उत्पन्न करता है। दूसरा, यह एंजाइमी एक के उपायctivity खुद को बजाय संबंधित हो सकता है, और यह प्रोटीन अभिव्यक्ति enzymatic गतिविधि में किसी भी बदलाव के बिना बढ़ाया जा सकता है कि जाना जाता है, जो प्रोटीन या शाही सेना अभिव्यक्ति,। इसके अलावा, spectrofluorometry अन्य ऊतकों पर या विभिन्न जानवरों की प्रजातियों के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है और अलग अलग substrates के साथ, अन्य कस्पासे उपप्रकार के लिए समायोजित किया जा सकता है, तो यह है कि सुरक्षित तुलना बनाया जा सकता है।
अंत में, इस दस्तावेज़ कि एपोप्टोसिस 3 दिन एमआई के बाद लिम्बिक सिस्टम के इस क्षेत्र में होता है सबूत उपलब्ध कराने, प्रमस्तिष्कखंड में कस्पासे 3 गतिविधि को मापने के लिए spectrofluorometry के उपयोग को दर्शाता है।
The authors have nothing to disclose.
। Santé – इस काम के प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा किम गिल्बर्ट इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया Fonds डे ला Recherche डु क्यूबेक से एक छात्रवृत्ति रखती है।
Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |