Myocardial infarction (MI) is not only followed by impaired cardiac function but also by apoptosis in the amygdala, a brain region involved in the behavioral consequences of MI. This protocol describes how to induce MI, collect amygdala tissue and measure caspase-3 activity, a marker of apoptosis, therein.
Hjärtinfarkt (MI) har dramatiska mitten och långsiktiga konsekvenser på de fysiologiska och beteendemässiga nivåer, men mekanismerna är involverade är fortfarande oklart. Vårt laboratorium har utvecklat en råttmodell av post-MI-syndrom som visar nedsatt hjärtfunktion, neuronal förlust i det limbiska systemet, kognitiva brister och beteendemässiga tecken på depression. På det neuronala nivå, medierar caspas-3-aktivering efter Ml apoptos i olika limbiska regioner, såsom amygdala – topp vid 3 dagar efter Ml. Kognitiva och beteende nedskrivningar visas 2-3 veckor efter MI och dessa korrelerar statist med åtgärder av kaspas-3-aktivitet. Protokollet som beskrivs här används för att inducera Ml, samla amygdala vävnad och mäta kaspas-3-aktivitet med användning spektrofluorometri. För att inducera Ml är nedåtgående kransartären ockluderades under 40 minuter. Protokollet för utvärdering av kaspas-3-aktivering startar 3 dagar efter Ml: råttorna avlivades och amygdala isolerade rapiDLY från hjärnan. Proverna frystes snabbt i flytande kväve och hölls vid -80 ° C fram till själva analysen. Tekniken utföras för att bedöma caspas-3-aktivering är baserad på klyvning av ett substrat (DEVD-AMC) genom kaspas-3, som frigör en fluorogen förening som kan mätas genom spektrofluorometri. Metodiken är kvantitativ och reproducerbar men den utrustning som krävs är dyra och förfarandet för kvantifiering av proverna är tidskrävande. Denna teknik kan tillämpas på andra vävnader, såsom hjärta och njurar. DEVD-AMC kan ersättas av andra substrat för att mäta aktiviteten hos andra kaspaser.
Kaspaser eller cystein-beroende aspartat riktad proteaser är en familj av enzymer som är involverade i olika homeostas processer som en. Kaspaser kan grovt klassificeras enligt deras roller i apoptos eller inflammation. Kaspas-1, -4, -5 och -12 är involverade i inflammation, medan de som ägnar sig apoptos kan vara sub-klassificeras som initiator kaspaser (kaspas-8 och -9) och bödel kaspaser (kaspas-3, -6 och -7 ).
Kaspaser spelar viktiga roller i många sjukdomar, främst i sjukdomar där apoptos kan vara överdriven, som observerats efter hjärtinfarkt (MI) eller cerebral ischemi.
I råttmodellen av post-MI syndrom som används i vårt labb, står det klart att kaspas-3 aktiveras inte bara i hjärtmuskeln 2 men också i det limbiska systemet, som är inblandad i kontrollen av humör och känslor 3-6. Det framgår också att caspas-3 aktiveras i olika regionerav det limbiska systemet, såsom amygdala och hippocampus, och detta aktiverings toppar runt 3 dagar efter ischemisk skada 4. Intressant, korrelerar kaspas-3-aktivitet med post-MI beteende nedskrivningar och dess dämpning genom farmakologiska och näringsrika ingripanden minskar dessa skador, vilket tyder på en möjlig koppling mellan kaspas-3 och efter MI depression 7-12.
Caspas-3-aktivering kan mätas genom olika tekniker. Western blotting konstaterar de enzymatiska egenskaperna hos kaspaser och kan detektera aktiva enzymer samt deras pro-enzymformer. Western blotting, dock är semikvantitativ, och små variationer kan förloras genom svaga signal-brusförhållanden 13. En bättre teknik är baserad på klyvning av ett substrat (DEVD-AMC) genom kaspas-3 som frisätter en fluorogen förening, och kan mätas genom spektrofluorometri. Caspas-3-aktivering är en pålitlig markör för apoptos. Mätning av apoptos can vara instabil eftersom tidsfönstret för händelsen är kort, och angränsande celler skulle fagocytera apoptotiska kroppar eller celler 14. Apoptos kan bekräftas ytterligare av andra tekniker, såsom terminalt deoxinukleotidyltransferas dUTP nick ändmärkning (TUNEL) analys, som detekterar DNA-fragmentering är resultatet av apoptotiska signalkaskader 6, eller förhållandet mellan pro- / antiapoptotiska proteiner, såsom Bax / BCL2 6.
Vår erfarenhet med detta protokoll under de senaste 10 åren har lett till identifiering av kritiska metodfrågor. För det första är snabb hjärna dissektion i en petriskål på krossad is viktigt att upprätthålla preparationskvalitet. För det andra måste man vara medveten om att vävnadsultraljudsbehandling är kortare för cerebral amygdala jämfört med andra typer av vävnader, såsom hjärta (10 sek) eller njurar (20 sek). För det tredje bör stor försiktighet vidtas för att noggrant blanda substratet innan den läggs till proven. Vi upptäckte variabla signaler när blandningssekvensen var otillräcklig. För det fjärde bör inga bubblor vara närvarande i kvartscell vid läsning proverna. Annars kan signalen ändras.
Vi gjorde en förändring under de senaste åren för att öka resultatens reproducerbarhet: ökande substrat volym för att undvika volym mindre än 1 pl. Ändå kan små variationer förekommer mellan på varandra följande analyser, och åtminstone 3 kontrollprover bör användas för attkontroll för variationer. Fluorescence åtgärder för dessa kontroller i genomsnitt och medelvärdet är satt till 100%. Fluorescence åtgärder i experimentella prover omvandlas i procent av kontrollprover.
En annan begränsning hos tekniken är att endast en del av vävnad som används och därför kunde kaspas-3-aktivitet underskattas. Faktum är kort i varje given cell tidsfönstret av apoptos och skulle kunna missas även om det förekommer i angränsande områden vid tiden för provtagning 1,4,15. Det omvända är också möjligt: apoptos kan vara särskilt intensiv i delar av vävnad, vilket resulterar i överskattning av kaspas-3-aktivitet. Vi rekommenderar användning av återstående vävnader (amygdala) för kompletterande tekniker, såsom Tunel analyser eller Bax / Bcl2 förhållande (se inledningen).
Spektrofluorometri har åtminstone två fördelar jämfört med Western blotting. Först, direkt genererar den kvantitativa data. För det andra, den mäter enzymatisk enctivity själv snarare än protein eller RNA-expression, som kan vara orelaterade, och det är känt att proteinuttryck kan ökas utan någon förändring av enzymatisk aktivitet. Dessutom kan spektrofluorometri utföras på andra vävnader eller med olika djurarter och kan justeras för andra kaspas subtyper, med olika substrat, så att säkra jämförelser kan göras.
Sammanfattningsvis demonstrerar detta dokument användningen av spektrofluorometri att mäta kaspas-3-aktivitet i amygdala, vilket ger bevis på att apoptos sker i detta område av det limbiska systemet 3 dagar efter Ml.
The authors have nothing to disclose.
. Detta arbete stöddes av ett bidrag från naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada Kim Gilbert har en STUDENT från Fonds de la recherche du Québec – Santé.
Spectroflurometer | Photon technology Instrument (now Horiba) | Ratiomaster M-40 | with DeltaRAM Random Access Monochromator |
Respirator | Harvard apparatus | 683 | small animal ventilation |
Glass cuvette | NSG precision cells | 3G10 | Optical Glass (340-2,500nm) 10 mm path |
Sonicator | Cole Parmer | 4710 series | |
Spectrometer | Varian | Cary 50 Bio |