VDJ-Seq: Dybt sekventering Analyse af omarrangeret Immunoglobulin tungkædegen at afsløre Klonal Evolution Mønstre af B-celle lymfom
Summary
This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.
Abstract
Forståelse tumor klonalitet er afgørende for forståelsen af de mekanismer, der er involveret i tumorigenese og sygdomsprogression. Desuden kan forstå de klonale sammensætning forandringer, der sker inden for en tumor i respons på visse mikromiljø eller behandlinger føre til udformning af mere sofistikerede og effektive metoder til at udrydde tumorceller. Imidlertid har sporing tumor klonale subpopulationer været en udfordring på grund af manglende skelnelige markører. For at løse dette problem blev en VDJ-seq protokol skabt til at spore klonale evolution mønstre af diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL) tilbagefald ved at udnytte VDJ rekombination og somatisk hypermutation (SHM), to unikke funktioner af B-celle lymfomer.
I denne protokol, blev biblioteker næste generations sekventering (NGS) med indeksering potentiale konstrueret af forstærket omlejrede immunglobulin tung kæde (IgH) VDJ region fra par af primær diagnose og tilbagefald DLBCL SAMPles. I blev opnået i gennemsnit mere end halvdelen million VDJ sekvenser pr prøve efter sekventering, som indeholder både VDJ omlejring og SHM oplysninger. Desuden blev tilpassede bioinformatik rørledninger udviklet til fuldt ud at udnytte sekvensinformation til karakterisering af IgH-VDJ repertoire inden for disse prøver. Desuden rørledningen tillader genopbygning og sammenligning af klonal arkitektur af individuelle tumorer, som gør det muligt undersøgelsen af klonal heterogenitet inden for de diagnose tumorer og fradrag af klonale evolution mønstre mellem diagnose og tilbagefald tumor par. Ved anvendelse af denne analyse til flere diagnose-tilbagefald par, vi afdækket centrale beviser for, at flere karakteristiske tumor evolutionære mønstre kunne føre til DLBCL tilbagefald. Derudover kan denne tilgang udvides til andre kliniske aspekter, såsom identifikation af minimal residual sygdom, overvågning tilbagefald fremskridt og behandlingsrespons, og undersøgelse af immun repertoires i ikke-lymfom sammenhænge.
Introduction
Kræft er en klonal sygdom. Siden tredive år siden, da Peter C. Nowell foreslog kræft klonal evolution model 1, har mange undersøgelser forsøgt at dissekere klonpopulationer inden tumorprøver og rekonstruere klonal ekspansion og evolution mønstre, der ligger til grund for tumorgenese processen 2. For nylig har hel-genom sekventering aktiveret efterforskere til at tage en dyb kig på klonal heterogenitet og evolution 3,4. Men på grund af manglen på medgørlige markører i mange celletyper, er det vanskeligt at udlede den præcise klonal arkitektur og evolutionære vej. Heldigvis er der en naturlig klonalitet markør i modne B-celler, hvorfra mange lymfoide maligne sygdomme, herunder DLBCL har oprindelse. Som reaktion på antigen stimulering, kan hver B-celle danner en enkelt produktiv IgH VDJ sekvens ved at deltage i en VH (variable), en D (diversitet) og et JH (sammenføjning) segment sammen fra en stor pulje af disse segmenter. Under denne process, kan små dele af den oprindelige sekvens slettes og yderligere ikke-template nukleotider kan tilsættes for at skabe et unikt VDJ omlejring. Denne specifikke VDJ omlejring kan nedarves i alle afkom af dette B-celle, derfor tagging individuel moden B-celle og dens afkom 5. Desuden optræder SHM på rekombinerede VDJ sekvenser i efterfølgende germinale center (GC) reaktion at indføre yderligere mutationer til udvidelse af antistoffet pool og styrkelse af antistofaffinitet 6. Derfor, ved at sammenligne og kontrasterende VDJ og SHM mønstre af lymfom prøver, der har gennemgået disse processer, intra-tumor heterogenitet kunne afgrænses og klonal evolution sti af sygdommen kan udledes.
Tidligere kunne VDJ omlejring og SHM identificeres ved PCR amplifikation af rekombinerede regioner, kloning af PCR-produkterne, og efterfølgende Sanger-sekventering for at opnå sekvensinformation. Denne tilgang ilow-throughput og lavt udbytte, hente kun en meget lille del af hele rekombineret VDJ repertoire, og hindrer karakterisering af den samlede gengivelse af klonal population inden for en given prøve. En modificeret tilgang blev skabt ved at generere NGS indekseret sekventering biblioteker fra VDJ PCR-produkter og udføre PE 2×150 bp sekventering til at få mere end en halv million rekombinerede VDJ sekvenser pr prøve. Desuden blev en brugerdefineret pipeline udviklet til at udføre kvalitetskontrol (QC), justere filter VDJ sekventering læser at identificere omlejringer og SHMS af hver læse- og udføre fylogenetisk analyse på den klonale arkitektur hver prøve. Desuden er der etableret en ny tilgang til yderligere at karakterisere de klonale evolution mønstre for prøver indsamlet på forskellige stadier sygdom.
Vi har anvendt denne teknik til DLBCL patientprøver. DLBCL er en aggressiv form for non-Hodgkin lymfom med hyppige tilbagefald i op til en thIRD af patienterne 7. DLBCL tilbagefald normalt forekomme tidligt, inden for 2 til 3 år efter den oprindelige diagnose, selv om nogle opstår efter 5 år 8. Prognose for tilbagefald patienter er dårlig, med kun 10% at opnå tre år progressionsfri overlevelse på grund af begrænsede behandlingsmuligheder. Dette er grundlaget for det presserende behov for nye tilgange til behandling af DLBCL tilbagefald 9,10. Men molekylære mekanismer forbundet med DLBCL tilbagefald er stadig stort set ukendt. Især rolle klonal heterogenitet ved diagnose og klonal evolution under DLBCL tilbagefald udvikling er i øjeblikket karakteriseret, hvilket gør det vanskeligt at definere en nøjagtig og nyttig biomarkør at forudsige tilbagefald. For at løse disse spørgsmål, anvendte vi vores VDJ-sekventering tilgang på flere par matchede primær diagnose-tilbagefald DLBCL prøvepar. To forskellige klonale evolutionære scenarier for tilbagefald fremgik af sammenligningen af de klonale arkitekturer mellem diagnose og tilbagefald SAMPles der tyder flere molekylære mekanismer kan være involveret i DLBCL tilbagefald.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grund af den næsten ubegrænset antal iterationer af sekvensinformation kodet af VDJ omlejring og SHM på IGH locus af humane B-celler, undersøgelse af hele IGH repertoire af high-throughput dybe sekventering viste sig at være en effektiv og omfattende måde at afgrænse klonal og sub-klonede B-celle populationer. Desuden kan denne strategi bruges til at studere klonal evolution vej B-celle tumor udvikling, remission, og tilbagefald ved at sammenligne de klonale og sub-klonede arkitekturer af patientprøver indsa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr Rita Shaknovich and members of Elemento lab, Melnick lab, and Tam lab for thoughtful discussions. We would also like to thank the Genomics Resources Core Facility at Weill Cornell Medical College for performing the VDJ-sequencing. YJ was supported by ASH Scholar Award. WT and OE are supported by Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE is supported by the NSF CAREER award, the Starr Cancer Consortium and the Hirschl Trust. We would also like to thank Katherine Benesch, JD, MPH for her generous support to this project.
Materials
| Ethanol | VWR | 89125-170 | 200 proof, for molecular biology |
| TE buffer | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA |
| Xylenes | VWR | EM-XX0055-6 | 500 ml |
| Proteinase K | Life Technonogies | 25530-015 | 100 mg |
| Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix | Promega | U1515 | 10 mM each nucleotide |
| 10x PCR Buffer | Roche | 11699105001 | Without MgCl2 |
| AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2 | Life Technonogies | 4311806 | 50 µl at 5 U/µl |
| Specimen Control Size Ladder | Invivoscribe Technologies | 2-096-0020 | 33 reactions |
| IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 5-101-0030 | 33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection |
| IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection | Invivoscribe Technologies | 1-101-0020 | 33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | 20 µl at 5 U/µl |
| 10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer | Corning (cellgro) | 46-011-CM | 6×1 L |
| 50X TAE BUFFER | VWR | 101414-298 | 1 L |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich | E1510 | 10 mg/ml |
| 25 bp DNA Ladder | Life Technologies | 10597011 | 1 µg/µl |
| 100 bp DNA Ladder | Life Technologies | 15628-019 | 1 µg/µl |
| UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | 500 g |
| 40% Acrylamide/Bis Solution | Bio-Rad Laboratories | 1610144 | 500 ml |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | 50 columns |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit | Life Technologies | Q32854 | |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| MiSeq | Illumina | ||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32872 | |
| Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2) | Illumina | FC-121-2001 | |
| Magnetic stand | Life Technologies | 4457858 | |
| Gel imaging system | Bio-Rad Laboratories | 170-8370 |
References
- Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
- Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
- Ding, L., et al. Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing. Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).
- Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations. BMC bioinformatics. 15, 35 (2014).
- Schatz, D. G., Ji, Y. Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination. Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).
- Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres. Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).
- Coiffier, B., et al. CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma. N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).
- Larouche, J. F., et al. Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome. J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).
- Friedberg, J. W. Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).
- Gisselbrecht, C., et al. Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).
- Lefranc, M. P. IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics. Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).
- Jiang, Y., et al. Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas. Genome biology. 15 (8), 432 (2014).
- Hanna, J., et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell. 133 (2), 250-264 (2008).
