VDJ-Seq: Deep Sequencing Analyse av omorganisert Immunoglobulin Heavy Chain Gene å avsløre Klonal Evolution Mønstre av B celle lymfom

Summary

This protocol describes an approach to interrogate the recombined immunoglobulin heavy chain VDJ regions of lymphomas by deep-sequencing and retrieve VDJ rearrangement and somatic hypermutation status to delineate clonal architecture of individual tumor. Comparing clonal architecture between paired diagnosis and relapse samples reveals lymphoma relapse clonal evolution modes.

Abstract

Forståelse svulst klonalitet er avgjørende for å forstå mekanismene som er involvert i tumorigenesis og sykdomsutvikling. I tillegg kan forstå de klonale sammensetningen endringer som oppstår i løpet av en tumor som reaksjon på visse mikro-miljø eller behandlinger fører til utforming av mer sofistikerte og effektive metoder for å utrydde tumorceller. Imidlertid har relativ tumor klonale subpopulasjoner vært vanskelig på grunn av mangel på skjelnes markører. For å løse dette problemet, ble en VDJ-seq protokollen opprettet for å spore klonal evolusjon mønstre av diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) tilbakefall ved å utnytte VDJ rekombinasjon og somatisk hypermutasjon (SHM), to unike funksjonene til B-celle lymfomer.

I denne protokollen, ble Next-Generation sekvensering (NGS) biblioteker med indeksering potensial konstruert fra forsterket omorganisert immunoglobulin tung kjede (avIgH) VDJ regionen fra par primærdiagnose og tilbakefall DLBCL SAMPles. I gjennomsnitt mer enn en halv million VDJ sekvenser per prøve ble oppnådd etter sekvensering, som inneholder både VDJ omorganisering og SHM informasjon. I tillegg ble tilpasset bioinformatikk rørledninger utviklet for å utnytte sekvensinformasjon for karakterisering av avIgH-VDJ repertoar innenfor disse prøvene. Videre gir rørledningen gjenoppbygging og sammenligning av klonal arkitekturen av individuelle tumorer, som gjør undersøkelsen av den klonale heterogenitet innenfor diagnose-tumorer og fradrag av klonal evolusjon mønsteret mellom diagnose og tilbakefall tumor parene. Ved søknad denne analysen til flere diagnose-tilbakefall parene, avdekket vi viktige bevis på at flere karakteristiske kreft evolusjonære mønstre kan føre til DLBCL tilbakefall. I tillegg kan denne tilnærmingen bli utvidet til andre kliniske aspekter, for eksempel identifisering av minimal restsykdom, overvåking tilbakefall fremgang og behandlingsrespons, og etterforskningen av immunrepertoares i ikke-lymfom sammenhenger.

Introduction

Kreft er en klonal sykdom. Siden tretti år siden, da Peter C. Nowell foreslo kreft klonal evolusjon modell ^1, har mange studier forsøkt å dissekere klonale populasjoner innen tumorprøver og rekonstruere klonal ekspansjon og evolusjonsmønstre som ligger til grunn tumorigenesis prosessen ^to. Nylig har hel-genomsekvense aktivert etterforskere til å ta en grundig titt på klonal heterogenitet og evolusjon ^3,4. Imidlertid, på grunn av mangel på medgjørlig markører i mange celletyper, er det vanskelig å utlede nøyaktige klonale arkitektur og Utviklingsretningen. Heldigvis er det en naturlig klonalitet markør i modne B-celler som mange lymfoide maligniteter, inkludert DLBCL, stammer. Som svar på antigen stimulering, kan hver B-celle danne et enkelt produktivt avIgH VDJ-sekvens ved å slutte et V _{H (variabel),} en D (diversitet) og en J _{H (delta)} segment sammen av et stort basseng av disse segmentene. I løpet av denne process, kan små deler av den opprinnelige sekvensen bli slettet og ytterligere ikke-malbasert nukleotider kan tilsettes for å skape et unikt VDJ-omleiring. Denne spesifikke VDJ omorganisering kan være arvelig i alt avkommet av dette B-celle, derfor tagging individuell moden B-celle og dens avkom ^5. Videre oppstår SHM på rekombinerte VDJ-sekvenser i det etterfølgende germinalsenter (GC) reaksjon for å innføre ytterligere mutasjoner for utvidelse av antistoffet bassenget og forbedring av antistoff affinitet ^6. Derfor, ved å sammenligne og kontrastere VDJ og SHM mønstre av lymfom prøver som har gjennomgått disse prosessene, intra-tumor heterogenitet kan være avgrenset og klonal evolusjon banen av sykdommen kan utledes.

Tidligere kunne VDJ omleiring og SHM bli identifisert ved PCR-amplifisering av de rekombinerte regionene, kloning av PCR-produktene, hvorpå Sanger-sekvensering for å oppnå sekvensinformasjon. Denne tilnærmingen jegs lav gjennomstrømning og lavt utbytte, hente bare en meget liten del av hele repertoaret rekombinerte VDJ, og hindrer karakterisering av den totale fremstilling av klonal populasjon i en gitt prøve. En modifisert tilnærming ble skapt ved å generere NGS indeksert sekvense biblioteker fra VDJ PCR-produkter og utfører PE 2×150 bp sekvensering for å få mer enn en halv million rekombinerte VDJ sekvenser per prøve. I tillegg ble det utviklet en rørledning tilpasset til å utføre kvalitetskontroll (QC), justere filter VDJ-sekvensering for å identifisere leser rearrangementer og SHMS av hver lese- og utføre fylogenetisk analyse på klonale arkitekturen i hver prøve. I tillegg har en ny tilnærming er etablert ytterligere å karakterisere klonal evolusjon mønstre for prøver samlet inn på ulike sykdomsstadier.

Vi har brukt denne teknikken for å DLBCL pasientprøver. DLBCL er en aggressiv form for non-Hodgkins lymfom med hyppige tilbakefall i inntil ett thIFU av pasientene ^7. DLBCL tilbakefall oppstår vanligvis tidlig, innen 2 til 3 år etter den første diagnosen, selv om noen oppstår etter 5 år ^8. Prognose for tilbakefall pasienter er dårlig, med bare 10% som oppnådde tre år progresjonsfri overlevelse på grunn av begrenset behandlingstilbud. Dette er grunnlaget for det presserende behovet for nye tilnærminger til behandling DLBCL tilbakefall ^9,10. Men molekylære mekanismer knyttet DLBCL tilbakefall er fortsatt i stor grad ukjent. Spesielt rollen klonal heterogenitet på diagnose og klonal evolusjon under DLBCL tilbakefall utvikling er i dag uncharacterized, noe som gjør det vanskelig å definere en nøyaktig og nyttig biomarkør for å forutsi tilbakefall. For å løse disse spørsmålene, vi brukt vår VDJ-sekvensering tilnærming på flere par matchet primærdiagnose-tilbakefalls DLBCL prøve par. To forskjellige klonale evolusjonære scenarier for tilbakefall dukket opp fra sammenligning av klonale arkitekturer mellom diagnosen og tilbakefall SAMPles som antyder flere molekylære mekanismer kan være involvert i DLBCL tilbakefall.

Protocol

1. VDJ Amplification 1.1) DNA Extraction fra tumorprøver Utdrag DNA fra tynne snitt (10-20 mm) av frosne OCT innebygde normale eller ondartet vev. Fordøye 10-30 tynne snitt av innleiret vev kuttet med en kryostat mikrotom i 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris-HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M Na2EDTA) med proteinase K (0,5 mg / ml, endelig konsentrasjon ) og 0,625% SDS i et 15 ml sentrifugerør i et 37 ° C vannbad over natten. Tilsett 1 ml mettet…

Representative Results

Den generelle fremgangsmåten fra VDJ sekvensering (VDJ-seq), inkludert DNA-ekstraksjon, rekombinert VDJ-regionen amplifikasjon og rensing sekvense bibliotek konstruksjon, leser behandling, og fylogenetisk analyse, er vist i figur 1. Rutinemessig 5-200 ug DNA kan hentes fra frosset fast vevssnitt eller 0,5-20 mikrogram DNA fra formalinfiksert parafin-vevssnitt. Avhengig av kvaliteten, omleiring mønster, og SHM graden av de enkelte prøver, kan et utvalg av VDJ PCR-produkter fra forskjellige prøver opp…

Discussion

På grunn av den nesten ubegrenset antall gjentakelser av sekvensinformasjon kodet av VDJ-omleiring og SHM ved IGH locus av humane B-celler, undersøkelse av hele IGH repertoaret av high-throughput deep-sekvensering viste seg å være en effektiv og fullstendig måte å avgrense klonal og sub-klonal B-celle populasjoner. Videre kan denne strategien kan brukes til å studere utviklingen klonal banen for B-celletumorutvikling, remisjon, og tilbakefall ved å sammenligne klonale og sub-klonale arkitekturer av pasientprøve…

Materials

Ethanol	VWR	89125-170	200 proof, for molecular biology
TE buffer	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris·Cl, pH 8.0; 10mM EDTA
Xylenes	VWR	EM-XX0055-6	500 ml
Proteinase K	Life Technonogies	25530-015	100 mg
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix	Promega	U1515	10 mM each nucleotide
10x PCR Buffer	Roche	11699105001	Without MgCl2
AmpliTaq Gold DNA Polymerase with Gold Buffer and MgCl2	Life Technonogies	4311806	50 µl at 5 U/µl
Specimen Control Size Ladder	Invivoscribe Technologies	2-096-0020	33 reactions
IGH Somatic Hypermutation Assay v2.0 – Gel Detection	Invivoscribe Technologies	5-101-0030	33 reactions, Mix 2 for IGVHFR1 detection
IGH Gene Clonality Assay – Gel Detection	Invivoscribe Technologies	1-101-0020	33 reactions, Tube B for IGVHFR2 detection
GoTaq Flexi DNA Polymerase	Promega	M8291	20 µl at 5 U/µl
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer	Corning (cellgro)	46-011-CM	6×1 L
50X TAE BUFFER	VWR	101414-298	1 L
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich	E1510	10 mg/ml
25 bp DNA Ladder	Life Technologies	10597011	1 µg/µl
100 bp DNA Ladder	Life Technologies	15628-019	1 µg/µl
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-500	500 g
40% Acrylamide/Bis Solution	Bio-Rad Laboratories	1610144	500 ml
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	50 columns
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Life Technologies	Q32854
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
MiSeq	Illumina
Qubit 2.0 Fluorometer	Life Technologies	Q32872
Resuspension buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Ligation mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
DNA adaptor index (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Stop ligation buffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR primer cocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
PCR master mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)	Illumina	FC-121-2001
Magnetic stand	Life Technologies	4457858
Gel imaging system	Bio-Rad Laboratories	170-8370