The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.
Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.
Den vigtigste fysiologiske rolle af skeletmuskulaturen mitokondrier er at producere ATP mod oxidativ phosphorylering 1. Vigtigere, spiller skeletmuskulatur mitokondrier en særlig rolle i arbejdskapacitet 2, aldring 3, degenerative sygdomme 4 og type II diabetes 5. Som et aldrende samfund, og type II diabetes er den 7. hyppigste dødsårsag i USA 6, er behovet for metoder, der vurderer mitokondriefunktion blevet stadig mere udbredt i biomedicinsk forskning 7,8. Konkret måling af ilt forbrug har særlig stor nytteværdi i vurderingen af mitokondrie funktion, da det repræsenterer en koordineret funktion mellem mitochondriale og nukleare genomer til at udtrykke funktionelle komponenter af oxidativ fosforylering 9.
Flere teknologier findes der muliggøre måling af iltforbruget i intakte celler og isolered mitokondrier 7-10. Desuden er der blevet udviklet assays for flere celletyper og væv, og i en række arter, der giver mulighed for måling af mitokondrielle veje og respiratorisk kontrol 9,11,12. Men der er i øjeblikket et tomrum i litteraturen i forhold til udarbejdelsen af alle disse analyser ved hjælp af isolerede mitokondrier fra mus skeletmuskulatur til brug i mikroplade baseret forbrug ilt teknologier. Vigtigere, er brug af mikrotiterplade-baseret respirometriske analyser voksende blandt mitokondrielle biologer og giver mulighed for høj kapacitet målinger ved hjælp minimale mængder af isolerede mitokondrier 9. Derfor blev en samling af mikrotiterplade-baseret respirometriske assays udvikles, der gør det muligt at indkredse hvor abnormiteter og / eller tilpasninger kan forekommer i elektrontransportkæden (ETC). Desuden blev to yderligere mikroplade baserede respirometriske analyser udviklet, der gør det muligt at vurdere koordineringen between tricarboxylsyre (TCA) cyklus og ETC og mellem ß-oxidation og ETC. Vigtigt er det, de præsenterede metoder giver en klar og koncis måde at måle mekanistiske ændringer i mitokondriefunktion i et almindeligt anvendt dyremodel.
De metoder, der præsenteres i denne artikel giver trin-for-trin instruktioner til udførelse af en samling af mikrotiterplade-baseret respirometriske assays under anvendelse af mitokondrier isolerede 75-100 mg mus skeletmuskulatur. Disse assays kan udføres med stor præcision, hvilket fremgår af den stramme standardafvigelse mellem tredobbelte brønde. Vigtigere, tillader disse respirometriske analyser indkredsning af, hvor abnormiteter og / eller tilpasninger kan forekommer i ETC, TCA-cyklus, β-oxidation vej, substrat transportører mv i et almindeligt anvendt dyremodel.
Det er vigtigt at understrege rationalet for anvendelse af forskellige brændsler og inhibitorer, der anvendes i denne protokol. Pyruvat / malat og glutamat / malat respirometriske assays muliggøre vurdering af kompleks I medieret respiration, samt en vurdering af deres respektive transportører, og i tilfælde af glutamat, den deaminase 15. Alternativt kombinationen afsuccinat / rotenon det muligt at vurdere mitokondrie respiratoriske flux gennem Kompleks II i ETC siden rotenon hæmmer kompleks I og succinat giver elektroner til Kompleks II via reduktion af flavinadenindinukleotid (FADH 2) 15. Disse analyser giver substrat specifikke oplysninger om, kobling effektivitet og maksimal åndedræt. Strømmen af elektroner assayet er enestående ved, at kombinationen af substrater og inhibitorer giver mulighed for vurdering af flere komplekser i mitokondrie respiratoriske flux 9. Den oprindelige substrat blanding af pyruvat / malat + FCCP giver mulighed for evaluering af maksimal respiration drevet af kompleks I, mens injektion af rotenon efterfulgt af succinat muliggør vurderingen maksimal respiration drevet af Complex II. Injektionen af antimycin, en inhibitor af Complex III, efterfulgt af injektion af ascorbat / TMPD tillade for evalueringen af respiration drevet af Complex IV siden ascorbat / TMPD er enelektrondonor til cytochrom C / Complex IV. Mens ingen oplysninger om koblingseffektivitet opnås, metoden er ideel til meget små stikprøvestørrelser, som udelukker kører flere substrater selvstændigt. Endelig kan brugen af palmitoyl carnitin / malat muliggør vurderingen af koordinering mellem β-oxidation og ETC siden den reducerende ækvivalent fremstillet ved oxidering af palmitinsyre (β-oxidation) indgå i ETC gennem elektron overførsel flavoprotein 15. Det skal bemærkes, at koblingen og elektronflow assays også kan anvendes i tandem til at identificere ændringer i mitokondriefunktion grund af nogle intervention (lægemiddelbehandling genmanipulation).
Den høje præcision opnås for disse assays skyldes primært grundig blanding af mitokondrier, hvad enten det er før proteinbestemmelse eller med substratet løsninger. Langs disse linjer, er når mitokondrier resuspendend i underlaget opklaringns, er det afgørende at blande denne opløsning grundigt før lastning celledyrkningspladen som beskrevet i trin 2.2 med en udvidet åbning pipettespids. Manglende blandes grundigt mitokondrier vil føre til stor variation inden assayet. Desuden, ved hjælp af en smal åbning pipettespids vil skabe forskydningskræfter under blanding mitokondrier og øger muligheden for at beskadige mitochondriemembraner og frigivelse af cytochrom C. trin vedhæftning (2,7) er også et afgørende skridt i denne protokol. Manglende dreje loaded celledyrkningspladen længe / hurtigt nok vil resultere i ufuldstændig vedhæftning af mitokondrier til brønden, hvilket fører øget variabilitet mellem brønde og målinger.
Den beskrevne protokol er blevet optimeret til at omfatte: lastning en optimal mængde af mitokondrie protein per brønd, bruger de rigtige koncentrationer / tilberedningsmetoder at lave lager og substratopløsninger, ændre analysekørsel at sikre mitokondrie tilstand plateaus, og passende blanding af mitokondrie lager og mitokondrie / substrat blandinger. Forud for disse optimering indsats, forfatterne stødt faldgruber i analysen løb. Følgende diskuterer fejlfinding metoder / ændringer, der var nyttige i at optimere denne protokol. Med hensyn til en optimal belastning, vil lastning for lidt mitokondrier ikke fremkalde en solid respons, under indlæsning for meget mitokondrier vil udtømme ilten i mikrokammer og føre til unøjagtige målinger. Rogers et al 9 indeholder eksempler på bestemmelse af optimale lastning mængder af mitokondrier pr godt for mikrotiterplade-baseret respirometriske analyser. Oftere, er for meget mitokondrier indlæst per brønd som det fremgår af staten 2 satser løbet 100-200 pmol / min / brønd og stat 3 rater> 1500 pmol / min / brønd. Hvis over lastning sker, udføre et eksperiment med varierende koncentration af mitokondrie protein (f.eks mellem 1 -. 10 ug) for at fremkalde OCRs inden den dynamiske range af iltforbrug måling maskine. Forberedelse og bruge de rigtige koncentrationer af substrater og lagre er af allerstørste betydning. Brug altid den sure form af substrater / injektioner og justere pH med kaliumhydroxid eller HCI; natrium buffere / løsninger anbefales ikke. Desuden resuspenderes substrater / bestande i DMSO eller 100% ethanol vil medføre svigt eller fejl måling. Sørg for at bruge 95% ethanol, hvor noteret. Det er almindeligt for palmitoyl carnitin at udfælde af 95% ethanol efter optøning af frossen stamme, hvilket forårsager store forskelle. Sørg for at varme op palmitoyl carnitin materiel og vortex godt før brug. Desuden kan en meget variabel pyruvat / malat analyseresultat skyldes pyruvat stock væsen> 2 uger gammel. Vær sikker på at omskabe frosne portioner af pyruvat hver 2. uge. Den analysekørsel blev ændret til 2-min-målinger for at sikre mitokondrie statslige plateauer. Hvis der ønskes observation af konsumption af ADP, forskeren kanforlænge måling tid under fanen "protokollen" under "Wizard Assay" forum. Endelig opstår stor variation, når mitokondrie lager og mitokondrier plus substratopløsninger ikke homogeniseres fuldt før pålæsning. Hvis variabilitet mellem brøndene er høj efter analysekørsel, skal du sørge for fuldt ud at blande substratopløsningen før næste eksperiment. Vortexes aldrig mitokondrier / substratopløsninger snarere omrøres, mask og forsigtigt tritureres med en udvidet åbning pipettespids.
Der er nogle begrænsninger ved denne teknik, som er værd at bemærke. For det første er antallet af brønde på celledyrkningspladen anvendt til disse assays er relativt lav (dvs.., 24 brønde og mindst 2 udpeget til tomme brønde). Hvis det ønskes at udføre alle 5 af disse assays på én plade, forskeren er kun i stand til at undersøge svarene fra en mus ad gangen. Imidlertid bør det bemærkes, at 96-brønds instrumenter til rådighed til higheR gennemløb. Det andet er der iboende styrker og svagheder i vurderingen af mitokondriel dysfunktion i isolerede mitokondrier i forhold til i intakte celler 1. Nogle svagheder omfatter have mindre fysiologisk relevans i forhold til intakte celler og inducerende artefakter fra isolation processen. Endelig succesen af denne metode er betinget af kvaliteten af det mitokondrielle isolation processen.
Selv om nogle af disse assays er blevet enten udviklet i forskellige systemer eller er blevet valideret i andre dyremodeller, de metoder, der præsenteres heri, er den første til at syntetisere alle de ovennævnte assays til optimal anvendelse i en multi-brønds iltforbrug måling maskine ved hjælp af musen skeletmuskel. Det er vigtigt, kan alle 5 af disse assays udføres med mængden af mitokondrier isoleret fra ~ 75 – 100 mg af muse skeletmuskulatur, hvilket giver høj kapacitet med minimal materiale. Af stor betydning, evne multi-brøndsforbrugsteknologier oxygen til at udføre assays med minimale mængder mitokondrier, kombineret med en optimeret isoleringsmetode, tillader forskeren at udføre en lang række andre forsøg med den resterende del af skeletmuskelvæv (f.eks., western blots, RT-PCR, enzymatiske assays, etc.), som ofte er en kamp med denne dyremodel.
Afslutningsvis metoder præsenteret heri giver trin-for-trin instruktioner til udførelse af en samling af mikrotiterplade-baseret respirometriske assays under anvendelse minimale mængder af mus skeletmuskulatur. Vigtigt er det, de præsenterede metoder kræver minimal mængder væv og mitokondrier. Når styr, vil de heri beskrevne teknikker tillader forskerne at bestemme en potentiel mekanisme af en forbindelse eller genprodukt på mitokondrie iltforbrug i et almindeligt anvendt dyremodel.
The authors have nothing to disclose.
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | Store at room temperature |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | Store at room temperature |
Potassium phosphate monobasic, minimum 99.0% | Sigma Aldrich | P5379 | Store at room temperature |
Magnesium chloride hexahydrate, ACS reagent, 99.0-102.0% | Sigma Aldrich | M9272 | Store at room temperature |
HEPES minimum 99.5% titration | Sigma Aldrich | H3375 | Store at room temperature |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | Store at room temperature |
Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | Store at 4°C |
Acid Free- BSA | |||
Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature |
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature |
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine | Sigma Aldrich | T7394 | Store at room temperature |
99%, powder [TMPD] | |||
Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
phenylhydrazone | |||
≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |
Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |