Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.
مختلة الميتوكوندريا العضلات والهيكل العظمي تلعب دورا في عملية التمثيل الغذائي تغير لاحظ مع الشيخوخة والبدانة ومرض السكري من النوع الثاني. المقايسات respirometric الميتوكوندريا من التحضيرات الميتوكوندريا المعزولة تسمح لتقييم وظيفة الميتوكوندريا، وكذلك تحديد آلية (ق) للعمل الأدوية والبروتينات التي تعدل الأيض. وغالبا ما تتطلب إجراءات العزلة الحالية كميات كبيرة من الأنسجة لانتاج الميتوكوندريا عالية الجودة اللازمة لفحوصات respirometric. الطرق الواردة في هذه الوثيقة تصف كيف عالية الجودة الميتوكوندريا المنقى (~ 450 ميكروغرام) يمكن عزله عن كميات ضئيلة (~ 75-100 ملغ) من الماوس العضلات والهيكل العظمي للاستخدام في قياسات الجهاز التنفسي إنتاجية عالية. توصلنا إلى أن طريقة عزلتنا ينتج 92.5 ± 2.0٪ الميتوكوندريا سليمة من خلال قياس النشاط سينسيز سترات طيفيا. بالإضافة إلى ذلك، أدى تحليل لطخة غربية في الميتوكوندريا المعزولة في التعبير خافت من cytosoالبروتين يسانس، GAPDH، والتعبير القوي للبروتين الميتوكوندريا، COXIV. عدم وجود الفرقة GAPDH بارزة في الميتوكوندريا المعزولة يدل على التلوث القليل من مصادر غير الميتوكوندريا أثناء إجراء العزل. الأهم من ذلك، وقياس معدل استهلاك O 2 مع لوحة الصغيرة القائمة على التكنولوجيا وتحديد نسبة السيطرة التنفسية (RCR) لفحوصات respirometric المترابطة معارض البالغ الاقتران (RCR؛ <6 لجميع المقايسات) والميتوكوندريا وظيفية. في الختام، إضافة خطوة تنميق منفصلة وسمحت تخفيض كبير بالمواتير سرعة تجانس طريقة عنها سابقا عزلة جودة عالية والميتوكوندريا تنقيته من كميات صغيرة من الماوس العضلات والهيكل العظمي الذي ينتج في الميتوكوندريا بالإضافة جدا أن نتيجة التنفس مع وظيفة عالية خلال صفيحة ميكروسكوبية مقرها المقايسات respirometirc.
The primary function of mitochondria is to produce ATP from oxidative phosphorylation. However, mitochondria have many other important cellular functions including but not limited to: the production and detoxification of reactive oxygen species, the regulation of cytoplasmic and mitochondrial calcium, organelle trafficking, ionic homeostasis, and involvement in apoptosis1,2. Therefore, it is not surprising that dysfunctional mitochondria play a role in many disease pathologies, such as aging, neurodegenerative diseases, cardiovascular disease, cancer, obesity, and diabetes3,4. Importantly, skeletal muscle mitochondria specifically are involved in many of these pathologies3-5.
Mitochondrial respiration assays using isolated mitochondria allow for the assessment of electron transport chain and oxidative phosphorylation function, and the determination of mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Mitochondrial isolation procedures exist for multiple tissue and cell types for a variety of species6,7. However, these procedures often require large quantities of tissue/cells for a high quality mitochondria yield necessary for classic respirometric assays.
Microplate based respirometirc assays allow for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria, often just several µg per well8. Therefore, we present a modification of previously published methods7 to allow for high quality mitochondria to be isolated from smaller quantities of mouse skeletal muscle for use in microplate based respirometirc assays. In addition, methods are provided to establish the quality of the mitochondrial isolation preparation and the integrity of the mitochondrial membranes. Given that skeletal muscle mitochondria are involved in many pathological conditions, the measurement of O2 consumption in mechanistically driven studies is becoming more prevalent in biomedical research9,10.
الطرق الواردة في هذه الوثيقة تقدم وصفا مفصلا لإجراء العزلة الميتوكوندريا من كميات ضئيلة (~ 75-100 ملغ) من الماوس العضلات والهيكل العظمي. هذا الإجراء العزلة هي قادرة على تسفر عن أداء عالية، الميتوكوندريا النقي (~ 450 ميكروغرام) كما يتضح من O 2 معدلات الاستهلاك، والقيم R…
The authors have nothing to disclose.
The Fralin Life Science Research Institute and The Metabolic Phenotyping Core at Virginia Tech supported this work.
Essentially Fatty | Sigma Aldrich | A6003 | N/A |
Acid Free- BSA | |||
Tris/HCl | Promega | H5123 | N/A |
KCL | Sigma Aldrich | P9541 | N/A |
Tris Base | Promega | H5135 | N/A |
EDTA | Sigma Aldrich | E6511 | N/A |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | N/A |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | N/A |
D-Mannitol | Sigma Aldrich | 63559 | N/A |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Scientific | 25200-056 | N/A |
Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder ≥99.0 % |
Fisher Scientific | BP3581 | N/A |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | N/A |
Sodium deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750 | N/A |
Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched | Sigma Aldrich | 238651 | N/A |
Single Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | N/A |
Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers | Fisher Scientific | 352360 | N/A |
Halt Protease & Phosphatse Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1861284 | N/A |
1.5mL microcentrifuge tubes with screw cap | Thermo Scientific | 3474 | N/A |
Zirconium Oxide beads | Fisher Scientific | C9012112 | N/A |
GAPDH antibody (1D4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-59540 | N/A |
Anti- COXIV antibody | Cell Signaling | 4844s | Any mitochondrial inner membrane protein will suffice |
Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 711-035-152 | N/A |
Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearh | 115-001-003 | N/A |
Triton-X100 | Sigma Aldrich | X100 | N/A |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | N/A |
Pyruvic Acid, 98% | Sigma Aldrich | 107360 | Store at 4°C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
Succinic Acid | Sigma Aldrich | S9512 | Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
L(-) Malic Acid, BioXtra, ≥95% | Sigma Aldrich | M6413 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
Palmitoyl L-carnitine chloride | Sigma Aldrich | P1645 | Store at -20°C |
Oligomycin A, ≥ 95% (HPLC) | Sigma Aldrich | 75351 | Store at -20°C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) | Sigma Aldrich | C2920 | Store at 2-8°C |
phenylhydrazone | |||
≥98% (TLC), powder [FCCP] | |||
Antimycin A from streptomyces sp. | Sigma Aldrich | A8674 | Store at -20°C |
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP] | Sigma Aldrich | A5285 | Store at -20°C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay |
Rotenone | Sigma Aldrich | R8875 | Store at room temperature |