从小鼠骨骼肌高通量微孔板呼吸测量最低数量的隔离线粒体

Summary

在这里，我们提出了一种先前报道的方法的修改，该方法允许从少量小鼠骨骼肌中分离高质量和纯化的线粒体。该程序导致高度耦合的线粒体，在基于微孔板的呼吸测定中具有高功能地呼吸。

Abstract

功能失调骨骼肌线粒体起到与老化，肥胖和II型糖尿病观察改变的代谢作用。从分离的线粒体制剂线粒体呼吸计测定允许对线粒体功能的药物和能调节代谢蛋白质的作用机制（多个）的评估，以及判定。目前的隔离程序往往需要大量的组织得到必要的透气性测定高品质的线粒体。本文所提出的方法描述了如何高品质纯化线粒体（〜450微克），可以从最小量的小鼠骨骼肌（〜75-100毫克）分离为高通量呼吸测量使用。我们确定了我们的隔离方法产生92.5±2.0％的完整线粒体通过测量柠檬酸合成酶的活性分光光度法。此外，在分离线粒体Western blot分析结果在微弱的表达cytoso的LIC蛋白，GAPDH，和线粒体蛋白质，COXIV的健壮表达。由于没有在分离线粒体的一个突出的GAPDH频带的指示小污染从隔离过程期间非线粒体来源。最重要的是_，O 2的消耗率与微板为基础的技术，并确定用于耦合呼吸计测定显示高度耦合的呼吸控制率（RCR）的测量（RCR;> 6对于所有测定）和功能性线粒体。总之，增加了一个单独的切碎工序和显著减少先前报道的方法的电动机驱动的均化速度已允许的高品质和纯化的线粒体从较少量的小鼠骨骼肌，其导致高度耦合的线粒体，随着高功能呼吸作用的隔离在基于微孔板respirometirc检测。

Introduction

线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化产生 ATP。然而，线粒体具有许多其他重要的细胞功能，包括但不限于：活性氧的产生和解毒、细胞质和线粒体钙的调节、细胞器运输、离子稳态和参与细胞凋亡^1,2。因此，功能失调的线粒体在许多疾病病理中发挥作用也就不足为奇了，例如衰老、神经退行性疾病、心血管疾病、癌症、肥胖症和糖尿病^3,4。重要的是，骨骼肌线粒体特别参与许多这些病理^3-5。

使用分离线粒体的

微孔板的呼吸计检测允许使用极少量的分离线粒体进行高通量测量，通常每孔只有几 μg⁸。因此，我们提出了对先前发表的方法⁷ 的修改，以允许从少量小鼠骨骼肌中分离出高质量的线粒体，用于基于微孔板的呼吸测定。此外，还提供了确定线粒体分离制剂质量和线粒体膜完整性的方法。鉴于骨骼肌线粒体与许多病理状况有关，在机械驱动的研究中测量 O₂ 消耗量在生物医学研究中变得越来越普遍^9,10。

....

Protocol

经批准的协议下进行的机构动物护理动物的研究和利用委员会在弗吉尼亚理工学院和州立大学。

1.设置（时间:〜45分钟）

1. 0.25％胰蛋白酶，分离缓冲液为线粒体（IBM）的1和IBM2在37℃水浴中解冻冷冻的商店。
2. 冲洗玻璃器皿和在70％乙醇接着通过高纯度水解剖仪器。
3. 由4部分IBM1稀释1份胰蛋白酶准备从0.25％胰蛋白酶股票0.05％胰蛋白酶溶液。
4. 混合蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物用细胞裂解缓冲液:在1.5ml微量离心管中与螺旋盖（1 100比）。
5. 等分试样5 ml的0.05％胰蛋白酶（5毫升/小鼠）入15ml塑料管。
6. 设置电机驱动组织匀浆80 RPM。

2.隔离骨骼肌线粒体（时间:〜90分钟）

1. 安乐死鼠标的CO ₂ 吸入，颈椎脱位。
2. 除去从股四头肌和腓肠肌，其中包括如在下面的步骤中描述的比目鱼（〜75-100 mg总）红肌:
   1. 剥离朝向鼠标皮肤。
   2. 去除脂肪垫在股四头肌原点。切附加到用细尖的剪刀髌骨股四头肌腱。
      注意:股四头肌由其上股骨近端的前部解剖位置识别。
   3. 慢慢地剪断骨和四头肌之间的腱膜，同时也避免了股动脉，解放从骨四头肌。切细尖的剪刀肌腱在原点上股骨解放股四头肌....

Results

柠檬酸合酶活性充当细胞膜的完整性，因为柠檬酸合酶位于线粒体内膜，并且因此不应该存在于线粒体中具有完整的膜悬浮液的测量。 图1表示非超声处理线粒体样品中的柠檬酸合酶活性带有超声处理相比样品相同的隔离。声波处理线粒体结果在统计学上显著增加柠檬酸合酶活性（P <0.01）。重要的是，以下的隔离线粒体的92.5±2.0％是完整的。

图2描述了 GAPDH和COXIV表达在分离线粒体和整个骨骼肌组织溶解液。 GAPDH是位于细胞溶质中的蛋白质，但也可以在转位后的细胞核中，而COXIV是位于线粒体内膜的蛋白质。 GAPDH和COXIV的表达是在整个TISS明显UE裂解液。在分离线粒体，COXIV的表达观察到，而GAPDH只有微弱的频带是显而易见的。这些结果表明良好线粒体隔离，由非线粒体成分的分离过程期间小的污染。

图3是从线粒体使用此协议中分离并用微孔板.......

Discussion

本文所提出的方法提供了从最小量的小鼠骨骼肌（〜75-100毫克）线粒体分离方法的详细描述。这种隔离方法能够产生高功能，纯粹的线粒体（〜450微克）就证明了_氧气的消耗速率，RCR值，最大的柠檬酸合成酶的活性和免疫蛋白的表达。重要的是，可用于多种respirometirc测定用微孔板基于_O 2的消耗技术，它允许高通量从这个过程中分离线粒体。

骨骼肌线粒体隔离往往需要苛刻的方法从周围的结缔组织和结构蛋白^7,16解放线粒体。因此，线粒体膜可以成为打乱，从而损害线粒体_的 O 2消耗的活性（以及因此的精度）在随后respiromeTRIC检测。由包括组织使用刀片组织切除后到先前描述的方案⁷切碎的额外步骤，一个显著降低转子速度为电动机驱动的均化是可能的（80转与1600转）。这些温和的均质化和再悬浮技术导致线粒体胎膜完整（92.5±2.0％）的高百分比，如从下面的分离过程中的柠檬酸合酶活性进行评估。我们的发现与Asmann 等人 ^17，以下从人骨骼.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
本质上是脂肪	Sigma Aldrich	A6003	N/A
无酸 - BSA
Tris/HCl	Promega	H5123	N/A
KCL	igma Aldrich	P9541	N/A
Tris Base	Promega	H5135	N/A
EDTA	Sigma Aldrich	E6511	N/A
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	N/A
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903	N/A
D-甘露醇	Sigma Aldrich	63559	N/A
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	Thermo Scientific	25200-056	N/A
氯化钠 白色结晶或结晶粉末 ≥99.0 %	Fisher Scientific	BP3581	N/A
十二烷基硫酸钠	Sigma Aldrich	L3771	不适用
脱氧胆酸钠	Sigma Aldrich	D6750	不适用
聚氧乙烯 （12） 壬基苯醚，支链	Sigma Aldrich	238651	N/A
单刃剃须刀片	Fisher Scientific	12-640	N/A
Falcon- 100 uM 尼龙细胞过滤器	Fisher Scientific	352360	N/A
终止蛋白酶 &磷酸盐抑制剂混合物	Thermo Scientific	1861284	N/A
1.5 ml 微量离心管，带螺旋盖	Thermo Scientific	3474	N/A
氧化锆珠	Fisher Scientific	C9012112	N/A
GAPDH 抗体 （1D4）	Santa Cruz Biotechnology	sc-59540	N/A
抗 COXIV 抗体	细胞信号传导	4844s	任何线粒体内膜蛋白就足够了
过氧化物酶偶联的 affinipure 驴，抗兔 IgG （H+L）	Jackson Immunoresearh	711-035-152	N/A
过氧化物酶偶联的 affinipure 山羊，抗小鼠 IgG （H+L）	杰克逊免疫研究	115-001-003	N/A
Triton-X100	Sigma Aldrich	X100	N/A
Pierce BCA蛋白质检测试剂盒	Thermo Scientific	23225	N/A
丙酮酸，98%	Sigma Aldrich	107360	储存在4 °C，pH 值为 7.4，在用于呼吸测定之前用 KOH
珀酸	Sigma Aldrich	S9512	在室温下储存，pH 值为 7.4，用 KOH 在用于呼吸测定之前
L（-） 苹果酸、BioXtra 和 ge;95%	Sigma Aldrich	M6413	在室温下储存，在用于呼吸测定前用 KOH 至 7.4
-谷氨酸	Sigma Aldrich	G1251	在室温下储存，在用于呼吸测定前用 KOH 储存至 7.4 分，在用于呼吸测定
榈酰 L-肉碱氯化	Sigma Aldrich	P1645	在 -20 &°C 下储存
寡霉素 A， ≥ 95% （HPLC）	Sigma Aldrich	75351	储存在 -20 °C;C
羰基氰化物 4-（三氟甲氧基）	Sigma Aldrich	C2920	储存在 2-8 度;C
苯腙
≥98% （TLC），粉末 [FCCP]
来自链霉菌属的抗霉素 A。	Sigma Aldrich	A8674	商店在 -20 °C
腺苷 5′-二磷酸二钾盐脱水 [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	储存在 -20 °C;C，在用于呼吸测定
藤酮	Sigma Aldrich	R8875	在室温下储存