फीडर मुक्त परिस्थितियों में सेंडाइ वायरस का उपयोग मानव परिधीय टी कोशिकाओं से प्रेरित स्टेम कोशिकाओं की पीढ़ी
Summary
This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.
Abstract
हाल ही में, IPSCs पुनर्योजी उपचार के लिए कोशिकाओं का एक नया स्रोत के रूप में ध्यान आकर्षित किया है। पैदा IPSCs के लिए प्रारंभिक विधि आक्रामक बायोप्सी और Transgenes के रेट्रोवायरल जीनोमिक प्रविष्टि के द्वारा प्राप्त त्वचीय fibroblasts पर भरोसा किया है, इन नुकसान से बचने के लिए कई प्रयास किए गए हैं। मानव परिधीय टी कोशिकाओं IPSCs पैदा करने के लिए एक अनूठा सेल स्रोत हैं। टी कोशिकाओं से व्युत्पन्न IPSCs टी सेल रिसेप्टर (TCR) जीन की rearrangements होते हैं और विशिष्ट प्रतिजन टी कोशिकाओं का स्रोत रहे हैं। इसके अतिरिक्त, जीनोम में टी सेल रिसेप्टर पुनर्व्यवस्था व्यक्तिगत सेल लाइनों लेबल और प्रत्यारोपित और दाता कोशिकाओं के बीच भेद करने की क्षमता है। IPSCs की सुरक्षित नैदानिक आवेदन के लिए, यह हानिकारक एजेंटों को नव सृजित IPSCs को प्रकाश में लाने के जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। भ्रूण गोजातीय सीरम और फीडर कोशिकाओं स्टेम सेल संस्कृति के लिए आवश्यक हो गया है, यद्यपि यह जोखिम को कम करने के लिए संस्कृति प्रणाली से उन्हें हटाने के लिए बेहतर हैअप्रत्याशित pathogenicity की। यह पता करने के लिए, हम अपरिभाषित रोगजनकों के लिए IPSCs को प्रकाश में लाने के जोखिम को कम करने के लिए सेंडाइ वायरस का उपयोग मानव परिधीय टी कोशिकाओं से IPSCs पैदा करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है। सेंडाइ वायरस से निपटने के उचित जैव सुरक्षा स्तर के साथ उपकरणों की आवश्यकता है, सेंडाइ वायरस संक्रमित जीनोम प्रविष्टि के बिना टी कोशिकाओं को सक्रिय, अभी तक उच्च दक्षता के साथ। इस प्रोटोकॉल में, हम सक्रिय टी सेल संस्कृति और सेंडाइ वायरस के संयोजन का उपयोग फीडर मुक्त परिस्थितियों में मानव परिधीय टी कोशिकाओं से IPSCs की पीढ़ी प्रदर्शित करता है।
Introduction
IPSCs पुनर्योजी चिकित्सा 1-3 के लिए कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण स्रोत के रूप में काफी ध्यान आकर्षित किया है। तिथि करने के लिए, IPSCs पैदा करने के लिए विविध तरीकों 4,5 सूचना दी गई है। इन के अलावा, मानव टी कोशिकाओं से उत्पन्न IPSCs क्योंकि सेल नमूना 6-8 की कम इनवेसिव विधि के विशेष हित के लिए किया गया है। इसके अतिरिक्त, टी कोशिकाओं से व्युत्पन्न IPSCs टी सेल रिसेप्टर (TCR) जीन की rearrangements होते हैं और इस प्रकार प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं 9,10 का स्रोत रहे हैं। इसलिए, टी सेल व्युत्पन्न IPSCs पैदा सुरक्षित रूप से पुनर्योजी चिकित्सा प्रगति के लिए उपयोगी है।
इस विधि अप्रत्याशित pathogenicity के जोखिम को कम करने की अवधारणा पर आधारित है। IPSCs की सुरक्षित नैदानिक आवेदन के लिए यह रोगजनकों 11 के लिए जोखिम के जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इससे पहले स्टेम कोशिकाओं के कई संस्कृति प्रणालियों में, भ्रूण गोजातीय सीरम और फीडर कोशिकाओं आवश्यक अभिकर्मक के रूप में इस्तेमाल किया गया है12 S। IPSC पीढ़ी अप्रत्याशित pathogenicity के जोखिम को कम करने के लिए हालांकि, संस्कृति प्रणाली से इन अभिकर्मकों दोनों को हटाने के लिए बेहतर है।
साथ ही, इस विधि से मरीजों और फीडर कोशिकाओं की श्रमसाध्य तैयारी से आक्रामक सेल नमूना से बचने का लाभ दिया है। टी सेल व्युत्पन्न IPSCs पहले से ही रोग अनुसंधान 13,14 में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है, क्योंकि इस विधि को भी रोगियों से रोग विशिष्ट IPSCs पैदा करने के लिए लागू है और उपयोगी है।
एक जीन वाहन के रूप में सेंडाइ वायरस (सेव) सदिश का उपयोग टी सेल reprogramming के तरीकों, के बीच उच्च दक्षता 7,16 साथ IPSCs उत्पन्न कर सकते हैं कि एक विधि है। Sev एक एकल असहाय आरएनए वायरस है और नकल के लिए एक डीएनए चरण की जरूरत नहीं है क्योंकि इसके साथ ही, IPSC पीढ़ी में इसके उपयोग मेजबान जीनोम 17-19 तोड़ने से बचा जाता है। इसलिए, हम सीरम fr में मानव परिधीय टी कोशिकाओं से IPSCs पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल की स्थापना की हैईई और Matrigel, mTeSR माध्यम का एक संयोजन का उपयोग फीडर मुफ्त की स्थिति, और सेव वैक्टर।
Protocol
Representative Results
Discussion
We describe a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells in serum-free and feeder-free conditions using a combination of matrigel, mTeSR medium, and SeV vectors. For clinical applications of iPSCs, it is important to have a protocol for stably generating iPSCs and a less-invasive method for cell sampling. Although generating iPSCs with the combination of matrigel and mTeSR medium showed lower reprogramming efficiency than that with knockout serum replacement (KSR) medium and feeder-cells, this combination achieves stable generation of iPSCs from donors16. Stable iPSC generation and less-invasive cell sampling has the advantage of being able to increase the number of donors for iPSC generation.
SeV vectors, a minus-strand RNA virus, is not integrated into the host genome. Therefore the risks of tumorigenesis can be avoided at the step of reprogramming factor induction20-24. Additionally, the feeder-free conditions, which use a combination of defined culture medium and matrigel instead of a feeder layer, make it possible to minimize the potential risks of exposure to unknown exogenous factors. The fusion of these techniques provides a less invasive and safer iPSC technology for regenerative medicine16.
Important steps in this protocol are the step of activating human T cells (Step 1) and infecting them with SeV vectors (Step 2). When no ESC-like colony is obtained in the culture dish at an optimal time after SeV infection, the following should be considered. First, the confluency of the mononuclear cells before T cell activation may not be appropriate because optimal activation of T cells is critical for SeV infection25,26. Too high a density of mononuclear cells leads to cell death, interfering with the proper activation of T cells. Too low a density of mononuclear cells also disturbs the proper activation and proliferation of T cells. Therefore, the confluency of mononuclear cells should be checked and adjusted accordingly. Second, the dosage of SeV vectors may not be sufficient. The induction efficiency of iPSC colonies depends on the dosage of the virus6. If no ESC-like colony is observed after SeV infection, the option of increasing the virus dosage up to an MOI of 15-20 should be considered. If signs of iPSC colony differentiation are observed, the frequency at which medium is changed may be increased up to every other day, or to every day when colonies are larger.
The limitation in this protocol consists of this method not being virus free. Although SeV for cell reprogramming is commercially available with ease, users need to prepare equipment according to the appropriate biosafety level. As another method for generating integration-free iPSCs, episomal vectors have been used until now27-29. Although episomal vectors can be used with equipment with a lower level of biosafety, episomal vectors might insert into the host genome at extremely low rates. Therefore, additional checks are required to confirm the disappearance of transgenes, as when using SeV.
There is another limitation in that this technique is not absolutely free from animal-derived products. Some substrates, such as matrigel, anti-CD3 mAb, dissociation solution and SeV solution are derived from animal products and are therefore associated with a risk of transferring xenogeneic pathogens. However, the reduction of animal-derived substrates in the culture system is meaningful for the clinical application of iPSC technology due to the lower risk.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी सहायता के लिए चिकित्सा की कीयो विश्वविद्यालय के स्कूल से Yoshiko Miyake, सायाका Kanaami, Chihana फुजिता, Miho यामागुची, Natsuko Henmi, और री Ohno धन्यवाद। इस काम आंशिक रूप से स्वास्थ्य अनुसंधान के परिणामों के व्यावहारिक उपयोग में तेजी लाने के लिए एक अनुसंधान एवं विकास सिस्टम सहायता कार्यक्रम, और पुनर्योजी चिकित्सा की प्राप्ति के लिए राजमार्ग कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया।
Materials
| Ficoll-Paque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-02 | |
| Purified NA/LE mouse anti-human CD3 | BD Pharmingen | 555336 | |
| KBM502 medium | KOHJIN BIO | 16025020 | Warm in 37 ℃ water bath before use |
| Bovine albumin fraction V solution | Gibco | 15260-037 | |
| BD Matrigel Matrix Growth Factor Reduced | BD Biosciences | 354230 | Thaw completely at 4℃ overnight and dilute it 50 times with Dulbecco's Modified Eagle's Medium before coating culture dishes |
| mTeSR1 medium kit | STEM CELL | 5850 | Warm at room temperature before use |
| Dissociation Solution | ReproCELL | RCHETP002 | |
| D-PBS(–) | Wako | 045-29795 | |
| SeV Vector kit CytoTune-iPS ver.1.0 | DNAVEC | DV-0303c | Thaw on ice before use |
| 100-mm tissue culture dish | Falcon | 353003 | |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 353078 | |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | |
| 15ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50ml Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 227261 |
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