We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.
Nevrale stamceller (NSC) i subventricular sonen av sideventriklene (SVZ) opprett olfactory neurogenesis hele livet i hjernen hos pattedyr. De suksessivt generere transitt forsterke celler (TACS) og neuroblasts som skiller i nerveceller når de integrere olfactory pærer. Emerging fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) teknikker har tillatt isolering av NSCs samt deres avkom, og har begynt å belyse genet regulatoriske nettverk i voksen nevrogene nisjer. Vi rapporterer her en cellesortering teknikk som gjør det mulig å følge og skille cellesyklus dynamikken i de ovenfor nevnte cellepopulasjoner fra den voksne SVZ med en lex / EGFR / CD24 trippel farging. Isolerte celler blir deretter belagt som adherente celler til å utforske i detaljer deres cellecyklusprogresjonen etter time-lapse video mikroskopi. For å oppnå dette, bruker vi transgen Fluorescens ubiquitinering Cell Cycle Indicator (FUCCI) mus der cellene er rød-fluorescerende During G en fase på grunn av en G en bestemt rød-Cdt1 reporter. Denne metoden har nylig avslørt at prolifererende NSCs gradvis forlenge sine G en fase under aldring, som fører til neurogenesis verdifall. Denne metoden er lett overførbare til andre systemer, og kan være av stor interesse for studiet av cellesyklus dynamikken i hjerneceller i forbindelse med hjernesykdommer.
Hvilende nevrale stamceller (NSC) er kilden for voksen neurogenesis en og kan konvertere til deres proliferative "aktivert" form uttrykker EGFR (aNSCs) 2. Når aktivert, de gir opphav til transitt forsterke celler (TACS) 3 og deretter neuroblasts som migrerer til olfactory pærer (OB) gjennom et rør av astrocytter og til slutt differensiere til neuroner 4,5. NSCs og deres avkom er organisert i spesialiserte "nisjer" arkitekturer langs sideventriklene, impliserer en myriade av faktorene som styrer deres spredning 6. Isoleringen og rensingen av SVZ nevrogene celler som er nødvendig for å belyse den komplekse molekyl reguleringen av deres proliferasjon, men har vært en utfordring for en lang tid på grunn av mangelen på spesifikke markører og tilpasset teknikker.
Nye metoder ved hjelp av flowcytometri har gjort mulig isolering av NSCs og their avkom fra den voksne SVZ 2,7-11. Bruke stamcelle markør Lex 12 sammen med neuroblast markør CD24 13 og en fluorescens EGF å merke EGFR på voksende celler 2, vi nylig utviklet en FACS strategi slik at rensing av fem av de viktigste SVZ nevrogene populasjoner: hvilende og aktivert NSCs, kvoter, umodne samt trekkende neuroblasts 9. Her beskriver vi detaljene i denne cellesortering teknikk, og hvor en lex / EGFR / CD24 trippel farging tillatt for første gang isolering av både hvilende og aktiverte NSCs.
Selv nevrogenesen vedvarer i løpet av voksenlivet, blir produksjonen av nye neuroner drastisk redusert i den aldrende hjernen 14. De fleste studier bli enige om en progressiv reduksjon i antall prolifererende stamceller i SGZ og SVZ 15-20. Konsekvensene er ikke ufarlige som aldersrelatert nedgang i neurogenesis i SVZ provoserer en reduksjon av newborn nevroner i olfactory pærer i alderen hjernen, til slutt fører til svekkelse i olfactory diskriminering i alderen mus 18. Belyse cellecykluskinetikken av nevrale stamceller er et viktig steg for å forstå mekanismene bak utviklingen av voksen nevrogenese under aldring. Nyere studier har undersøkt cellesyklusen og avstamning progresjon av voksen nevrale stamceller in vitro 21 og in vivo 22, men ingen av dem benyttet av cellesorteringsteknikker og genetisk kodede fluorescerende celle-syklus prober for å visualisere celle-syklusfaser isolerte celler ved en enkeltcellenivå.
Her beskriver vi en protokoll som tar nytte av de transgene FUCCI mus der cellene er fluorescerende under cellesyklusen, slik at skillet mellom G 1 og SG 2 / M faser 23. Denne protokollen viser hvordan potensielle isolering av NSCs og deres avkom fra voksen FUCCI mice kombinert med time-lapse videomikroskopi tillater studiet av cellesyklus dynamikken ved en enkelt-celle-nivå.
Cellen sortering teknikken beskrevet her gir pålitelig diskriminering mellom hvil NSCs, aktiverte NSCs og deres avkom muliggjør studier av deres egenskaper og dynamikk i den voksne hjernen 9. Sammen med FUCCI teknologi som muliggjør visualisering av cellesyklusutvikling i levende celler 23, har vi utviklet en rask og effektiv teknikk for å følge G 1 og 2 SG / M-fasene av cellesyklusen fra unge voksne og eldre mus hjerneceller.
Den cellesortering teknikk som brukes i denne protokollen var det første validerte kombinasjon av markører som tillater rensing av de fem viktigste nevrogene populasjoner fra SVZ 9. Det var også den første validert teknikk muliggjør æren av hvilende og aktiverte NSCs. Det er bemerkelsesverdig at denne teknikken ikke krever anvendelse av transgene mus per se, noe som er nødvendig når det er tilpasset for å transgene musemodeller such som FUCCI. Siden da Gazzettino et al. 10 er brukt et GFAP-GFP / CD133 / EGFR trippel merking kombinasjon for å skille hvil NSCs fra deres aktiverte motstykke, men det kan ikke tilpasses til FUCCI teknologi da den krever bruk av GFAP-GFP transgene mus. Mich et al. 11 har utviklet en Glast / EGFR / CD24 trippel merking strategi som deler felles resultater med den teknikk som brukes i denne undersøkelsen 9. Faktisk en høy korrelasjon mellom Lex og Glast NSCs markører ble allerede observert i Daynac et al. Studere ni. Imidlertid er Glast antistoff som brukes i Mich et al., Teknikk koplet til fykoerytrin og kan derfor ikke tilpasses med bruk av FUCCI-røde mus.
Det er flere viktige tekniske punkter som krever oppmerksomhet før sortering SVZ celler. For det første er det meget viktig trinn dissosiasjon som hjernevevet har til å bli dissosiert til enkeltceller og samtidig bevare den strukturelle iintegriteten for proteinene som benyttes for merking av antistoffet strategi. 0,05% trypsin-EDTA har vist seg å være svært effektiv i dissociating SVZ vev 27 men lex antigen ble funnet å være svært følsom som nesten alle lex-FITC immunfluorescens var tapt (data ikke vist). Således, papain ble anvendt som det var mer effektiv og mindre ødeleggende enn andre proteaser i hjernevev. Videre ble verken lex eller EGFR heller CD24 påvirket av papain behandling. Det bør bemerkes at antistoffet Merkingen ble endret hvis papain behandling oversteg 15 min. Vi fikk optimale resultater med en 10 min papain behandling assosiert med en mekanisk dissosiasjon (pipette opp og ned 20 ganger).
De poly-D-lysin-belegg lar kultur av adherente celler og dannelsen av kolonier etter flere dager i kultur. Det er nå allment akseptert at in vitro-analyser kommer med sine begrensninger 28,29. Vi anbefaler å bestemme bare den første cellesyklusen forcellene som gjennomgår i det minste en etterfølgende divisjon å holde så nær som mulig til in vivo-celle-fenotype.
Det er bemerkelsesverdig å nevne at Geminin (grønn fluorescens) og Cdt1 (rød fluorescens) proteiner brukes til å designe den FUCCI system 23 ble tidligere vist seg å være klinkende uttrykt av nevrale stamceller under tidlig neurogenesis i mus 30 og i voksen hjerne vev 9,25 . Selv om mKO2-hCdt1 (30/120) konstruksjonen ble hovedsakelig brukt i denne studien å følge G1 fasen med rød fluorescens, bruk av både konstruerer [mKO2-hCdt1 (30/120) og MAG-hGem (1 ett hundre og tiendedel) ] kan forestilles for å tillate visualisering av de viktigste fasene i cellesyklus (G 1 og 2 SG / M), så vel som en G / S overgangen 23. Den største ulempen med dual-color bildebehandling er de begrensede kompatible sett med fluorescens som fortsatt kan brukes til cellen merking. En løsning er å bruke separatipå søyler. For eksempel har vi lykkes utarmet den CD24-positive brøkdel fra celler ved hjelp av separasjonskolonner før celle sortering og live-bildebehandling som vi brukte en CD24-PE antistoff som delte den samme utslipp bølgelengde enn FUCCI-Red fluorescens 25.
Få studier har undersøkt cellesykluslengden av voksne mus SVZ populasjoner. Det totale cellesykluslengde oppnås med vår teknikk ligger i nærheten av en estimert in vitro ved Costa et al. 21, men vi var i stand for første gang for å skille de forskjellige cellesyklusfaser. I en in vivo-undersøkelse, Ponti et al. 22 anvendes inkorporeringen av tymidin-analoger for å bestemme proliferasjons- dynamikken i ulike SVZ cellepopulasjoner. De kan imidlertid verken utføre en kontinuerlig kontroll av cellesyklus og heller ikke spor av cellene på enkeltcellenivå. Dette kan være et problem som det ble vist at en sterk heterogenitet finnes viddhin en gitt SVZ cellepopulasjon 22,25. Vi beskriver her et alternativ in vitro teknikk, enkel å sette opp, som gjør at levende avbildning av cellesyklus faser av forskjellige voksne nevrogene befolkninger i en enkeltcellenivå.
Forståelse av reguleringen av cellesyklusen av nevrale stamceller og progenitorer fortsatt en utfordring for utvikling av nye terapeutiske tilnærminger i forbindelse med aldring eller hjernesykdommer. Vår protokollen kan dermed ha et bredt spekter av applikasjoner. I sammenheng med aldring, kan denne teknikken også være nyttig for å forstå effekten av aldring på NSCs differensiering. Faktisk er det mulig å identifisere neuralstamceller / stamceller påbegynner differensiering som deres røde fluorescerende intensitet er tydelig høyere 26. Til slutt, kan det også være av interesse å utnytte den kontinuerlige levende avbildning på en encellet nivå for å studere celle indre og ytre prosesser som er ansvarlige for avstamning progression av voksne NSCs.
The authors have nothing to disclose.
Vi står i gjeld til C Joubert, V Neuville, V Barroca, J Tilliet og alle ansatte i dyre fasiliteter; til J Baijer og N Dechamps for celle sortering; O. Etienne for teknisk assistanse, og A. Gouret for henne administrativ bistand. Flowcytometri og cellesortering ble utført ved iRCM flowcytometrisystemer delt ressurs, etablert av utstyrsstipend fra DIM-Stem-pol, INSERM, Fondation ARC, og CEA. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd av Electricité de France (EDF). MD har et fellesskap fra La Ligue Contre le Kreft og LM fra Région Île-de-France (DIM Biothérapies). Marc-André Mouthon og François D. Boussin aksje co-senior forfatterskap.
96-well uncoated glass bottom culture plates | MatTek Corp. | P96G-1.5-5-F | |
µ-Plates 96-well | Ibidi | 89626 | |
Poly-D-Lysine | Millipore | A003E | |
NeuroCult NSC Basal Medium | STEMCELL Technologies | 5700 | |
NeuroCult NSC Proliferation Supplement | STEMCELL Technologies | 5701 | |
Heparin | STEMCELL Technologies | 7980 | |
EGF | Millipore | GF144 | |
FGF-2 | Millipore | GF003 | |
Papain | Worthington | LS003119 | |
EBSS | Invitrogen | 24010-043 | |
L-cysteine | Sigma | C-7352 | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Promega | V4231 | |
DNase I | Sigma | D5025-15KU | |
Trypsin inhibitor type II | Sigma | T9128 | Ovomucoid |
DMEM:F12 medium | Life Technologies | 31330-038 | |
20 µm filter | BD Medimachine Filcon | 340622 | |
Eppendorf microtubes 3810X | Sigma | Z606340-1000EA | |
BSA | Sigma | A1595 | Bovine serum albumin solution |
CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7] | Life Technologies | A14776 | Mouse IgM; clone MMA. 1:50 |
CD15/LeX fluorescein isothiocyanate [FITC] – conjugated | BD Biosciences | 332778 | Rat IgG2b; clone M1/69. 1:50 |
Mouse anti-human LeX antibody | BD Pharmingen | 559045 | Mouse IgM; clone MAM. 1:50 |
Alexa647 – conjugated EGF ligand | Life Technologies | E35351 | 1:200; Ax647-conjugated EGF ligand in the text |
CompBeads | BD Biosciences | 644204 | |
MACS LS separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | separation columns (in the manuscript) |
Anti-mouse IgM microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-301 | |
Hoechst 33258 | Sigma | 861405 | HO (in the manuscript) |
INFLUX cell sorter | BD Biosciences | FACS sorter (in the text) | |
Nikon A1R confocal laser scanning microscope system attached to an inverted ECLIPSE Ti | Nikon Corp. | confocal laser scanning microscope (in the manuscript) | |
NIS-Elements AR.4.13.01 64-bit software | Nikon Corp. | NIS-Elements software (in the manuscript) | |
Plan Apo VC 20x DIC objective (NA: 0.75) | Nikon Corp. | ||
ECLIPSE Ti thermostated chamber | Nikon Corp. | thermostated chamber (in the manuscript) | |
ImageJ | RBS | ||
FlowJo | Tree Star, Ashland, OR | ||
FUCCI mice | RIKEN BioResource Center, JAPAN | Sakaue-Sawano et al. 2008 |