का प्रयोग<em> पूर्व Vivo</em> पूरे भ्रूण अंगों की ईमानदार बूंद संस्कृतियों माउस जीवोत्पत्ति के दौरान विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
गर्भाशय में जीवोत्पत्ति की जांच कर गर्भाशय के भीतर विकसित भ्रूण कि वजह से अभिकर्मकों की पहुंच को अपरा स्तनधारियों में एक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है। एक नव विकसित पूर्व vivo ईमानदार छोटी बूंद संस्कृति विधि गर्भाशय में प्रदर्शन के अध्ययन के लिए एक आकर्षक विकल्प प्रदान करता है। पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति की जांच करने और विभिन्न अवरुद्ध और सक्रिय करने के यौगिकों के उपयोग के माध्यम से बातचीत सेलुलर और विविध संकेत दे रास्ते में हेरफेर करने की क्षमता प्रदान करता है; इसके अतिरिक्त, विशिष्ट अंगों के विकास पर विभिन्न औषधीय अभिकर्मकों के प्रभाव गर्भाशय में प्रणालीगत दवा वितरण की अवांछित दुष्प्रभावों के बिना अध्ययन किया जा सकता है। इन विट्रो प्रणालियों में अन्य की तुलना में, छोटी बूंद संस्कृति स्तनधारी सेल लाइनों में reproduced नहीं किया जा सकता है, जो तीन आयामी morphogenesis और सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने की क्षमता है, के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी काफी कम आर की आवश्यकता ही नहीं हैपूर्व vivo अन्य की तुलना में और इन विट्रो प्रोटोकॉल में eagents। इस पत्र विधि के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए पूरे अंग immunofluorescence द्वारा पीछा उचित माउस भ्रूण अंग विच्छेदन और ईमानदार छोटी बूंद संस्कृति तकनीक, यह दर्शाता है। पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति विधि तुलनीय विवो में मनाया जाता है और इन विवो मॉडल में भ्रूण मारक के कारण अन्यथा मुश्किल-अध्ययन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, उन्हें करने के लिए अंग वास्तुकला के गठन की अनुमति देता है। एक मॉडल के आवेदन प्रणाली के रूप में, एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला वृषण morphogenesis में vascularization की भूमिका की जांच करने के लिए उपयोग किया जाएगा। प्रत्येक अंग बड़े पैमाने पर होना प्रोटोकॉल के लिए किसी भी अंग विशेष संशोधनों का निर्धारण करने के लिए अध्ययन करना चाहिए, हालांकि यह पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति विधि, जैसे फेफड़ों और संभवतः दूसरों के रूप में अन्य भ्रूण अंग प्रणालियों, करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इस अंग संस्कृति प्रणाली भ्रूण अंगों के साथ प्रयोग में लचीलापन प्रदान करता है, और obtaine परिणामडी शोधकर्ताओं भ्रूण के विकास में अंतर्दृष्टि पाने में मदद मिलेगी इस तकनीक का उपयोग।
Introduction
मानव में विवो में अंग उत्थान बहुत सीमित है; इसलिए, ऊतक इंजीनियरिंग, ऊतकों और एक मेजबान के द्वारा दान में व्यक्ति की कोशिकाओं से अंगों के विकास, अंग प्रतिस्थापन के लिए एक आकर्षक संभावित चिकित्सा होता जा रहा है। इस चिकित्सकीय रणनीति सफल होने के लिए हालांकि, कारकों और अंग के morphogenesis में शामिल सेलुलर बातचीत अच्छी तरह से अध्ययन किया जाना चाहिए और अच्छी तरह से समझ में आया। पारंपरिक तरीकों के साथ विशिष्ट अंगों के विकास का अध्ययन करने में असमर्थता के कारण, शोधकर्ताओं वैकल्पिक पूरे भ्रूण या पूरे अंग संस्कृतियों के लिए खड़ा हो गया है। Kalaskar एट अल। 1 कि पूर्व vivo संस्कृति तरीकों जीवोत्पत्ति के अध्ययन के लिए एक व्यवहार्य विकल्प हैं, सुझाव गर्भाशय विकास में करने के लिए (सुसंस्कृत भ्रूण के 58% में) है कि पूर्व vivo पूरे भ्रूण संस्कृति तुलनीय परिणाम पैदावार से पता चला है।
एक व्यक्तिगत अंग संस्कृति प्रणाली, इस तरह के रूप में इस पूर्व vivo Droऔषधीय अभिकर्मकों या एंटीबॉडी के अलावा के माध्यम से एक विशिष्ट संकेतन मार्ग या सेलुलर बातचीत के हेरफेर अनुमति है, जबकि plet संस्कृति प्रणाली, प्रणालीगत प्रभाव के पूरे अंग विश्लेषण स्वतंत्र के लिए अनुमति देता है। परंपरागत रूप से, भ्रूण अंग विकास के अध्ययन माता के रूप में वितरित औषधीय अभिकर्मकों के अलावा, ट्रांसजेनिक और पीटकर माउस प्रौद्योगिकियों तक ही सीमित कर दिया गया है। हालांकि, विवो में इन तकनीकों और उपचार से जुड़े तकनीकी मुद्दे हैं; सबसे चिंताओं अक्सर भ्रूण मारक में जो परिणाम एक साथ विभिन्न अंगों को प्रभावित करने के प्रभाव के आसपास घूमता है। भ्रूण के विकास में हेर-फेर के अध्ययन का एक अतिरिक्त चिंता औषधीय ऐसे अभिकर्मकों अपरा बाधा के माध्यम से पारित कर सकते हैं (जैसे, दवा की मातृ चयापचय यह भ्रूण तक पहुंचने से पहले) और गर्भाशय में भ्रूण के विकास पर दवाओं के मातृ प्रभाव है।
पूरे अंग संस्कृति तकनीक का वर्णनयहाँ पूरे भ्रूण जननग्रन्थि पूर्व vivo ईमानदार छोटी बूंद संस्कृतियों में incubated रहे हैं, जिसमें पहले Maatouk एट अल। 2 द्वारा वर्णित एक प्रोटोकॉल, से लिया गया था। भ्रूण जननग्रन्थि संवर्धन में से एक महत्वपूर्ण लाभ छोटे अणु अवरोधकों को आसानी से सरल प्रसार द्वारा पूरे अंग का उपयोग कर सकते हैं। । DeFalco एट अल छोटे अणु inhibitors के साथ संयोजन के रूप में इस पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति विधि का उपयोग प्रक्रियाओं और जननद विकास 3 के दौरान होने वाली बातचीत के संकेत अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि पता चला है; इन प्रक्रियाओं की वजह से तकनीकी चुनौतियों के लिए विवो में जांच करने के लिए मुश्किल होगा (जैसे, नाल या आनुवंशिक या औषधीय दृष्टिकोण का उपयोग कर कई अंगों को प्रभावित करने की मारक के माध्यम से दवाओं के पारित होने)।
छोटी बूंद संस्कृति न केवल गर्भाशय प्रयोग में कुछ पहलुओं ओवर में एक सुधार है, लेकिन यह भी इन विट्रो और पूर्व छठी पर एक सुधार हैवो सिस्टम के रूप में अच्छी तरह से। वे विविध प्रकार की कोशिकाओं की कमी अंग वास्तुकला के गठन की अनुमति है कि महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) घटकों की कमी है, और cascades संकेत में कलाकृतियों का प्रदर्शन कर सकते हैं क्योंकि morphogenesis अध्ययन करने के लिए सेल लाइनों का उपयोग बेहद मुश्किल है। ऊतक इंजीनियरिंग ईसीएम अनुकरण मचानों बनाने में महत्वपूर्ण सुधार किए गया है, संकेतों जीवोत्पत्ति के दौरान प्रत्येक कोशिका प्रकार के लिए आवश्यक हैं, जो करने के संबंध में ज्ञान की कमी के कारण यह चुनौतीपूर्ण विट्रो में एक अंग प्रणाली का निर्माण करने के लिए बनाता है। अन्य पूर्व vivo सिस्टम पहले से, फिल्टर 6, और अन्य पाड़ मेट्रिसेस 7.8 जीवोत्पत्ति अध्ययन करने के लिए स्थापित किया है, या अधिक विशेष Morphogenesis, और अगर 4 में भ्रूण अंगों के रहते इमेजिंग के लिए बहुत सफल रहे हैं, 5 transwells कर दिया गया है। छोटी बूंद संस्कृति प्रणाली का लाभ यह है ओ रहे हैं जो कम अभिकर्मकों, उपयोग करने की क्षमता प्रदान करके morphogenesis के अध्ययन की अनुमति देता हैften महंगा है, लेकिन यह भी विकास और संकेत क्षमताओं 9 के लिए महत्वपूर्ण है, जो अंग सतह तनाव, दे रही है।
माउस में, प्रारंभिक वृषण morphogenesis भ्रूण (ई) के बीच होता है E11.5 और E13.5 चरणों; इन चरणों में सेक्स-विशिष्ट भेदभाव को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच के लिए इष्टतम समय खिड़की शामिल। वृषण गठन के दौरान होती है कि महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं के अलावा वृषण कॉर्ड वास्तुकला की पीढ़ी और एक वृषण-विशिष्ट संवहनी नेटवर्क के गठन कर रहे हैं। इस पूर्व vivo पूरे अंग छोटी बूंद संस्कृति प्रणाली का उपयोग, एक पुरुष-विशिष्ट vascularization में परिवर्तन और एक छोटे अणु अवरोध करनेवाला के उपयोग के माध्यम से वृषण morphogenesis को बाधित करने में सक्षम है कि ब्लॉक संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) के लिए रिसेप्टर्स की गतिविधि; वीईजीएफ़ की मध्यस्थता संवहनी remodeling वृषण विकास 10-12 के लिए महत्वपूर्ण है। इस तकनीक को सफलतापूर्वक अन्य अंगों के लिए लागू किया जा सकता है और विशिष्ट समय लक्षित कर सकते हैंविकास की खिड़कियां। साबुत माउंट अंग इमेजिंग महत्वपूर्ण संरचनाओं के दृश्य के साथ ही विभिन्न अवरोधकों के प्रशासन से उत्पन्न संरचनात्मक और सेलुलर परिवर्तन की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रणाली के शोधकर्ता इन विवो लक्षित जीन रणनीतियों के दौरान मातृ औषधि प्रशासन या प्रणालीगत व्यवधान से संभावित confounding प्रभाव बायपास कर सकते हैं कि में फायदेमंद है। इस प्रकार, इस पूरे अंग पूर्व vivo छोटी बूंद संस्कृति प्रणाली काफी भ्रूण के विकास के दौरान विशेष अंगों के भीतर विशेष रूप से पाए जाते हैं, जो बातचीत और संकेतन को समझने की क्षमता में सुधार कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए कई संभावित अनुप्रयोगों है कि एक पूर्व vivo पूरे अंग छोटी बूंद विधि दर्शाता है। इस तकनीक की वजह से भ्रूण और संभावित भ्रूण मारक के पहुंच के लिए जैविक विवो म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
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