वयस्क zebrafish में रक्त परीक्षण के लिए बार-बार रक्त संग्रह
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
बार-बार रक्त संग्रह प्रयोगशाला जानवरों पर प्रदर्शन सबसे आम तकनीकों में से एक है। हालांकि, zebrafish से रक्त संग्रह के लिए एक गैर घातक प्रोटोकॉल स्थापित नहीं किया गया। zebrafish से रक्त संग्रह के लिए पिछले विधियों ऐसे पार्श्व चीरा, कत्ल और पूंछ पृथक रूप में घातक हैं। इस प्रकार हम यहां इस प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल एक उपन्यास "दोहराया" रक्त संग्रह विधि विकसित की है, और वर्तमान है। इस विधि को न्यूनतम इनवेसिव है और इस प्रकार एक ही व्यक्ति से बार-बार रक्त नमूने को सक्षम करने, zebrafish के लिए एक बहुत कम मृत्यु दर (2.3%) में यह परिणाम है। रक्त नमूने की अधिकतम मात्रा मछली के शरीर के वजन पर निर्भर है। अंतराल पर दोहराया रक्त नमूना लेने के लिए मात्रा रक्त में हीमोग्लोबिन की माप द्वारा मूल्यांकन किया गया है, जो शरीर के वजन हर हफ्ते या ≤1% हर 2 सप्ताह के ≤0.4% होना चाहिए। इसके अतिरिक्त, हीमोग्लोबिन, रक्त ग्लूकोज उपवास, प्लाज्मा triacylglycerol (टीजी) और कुल गपुरुष और महिला वयस्क zebrafish में holesterol स्तरों मापा गया। हम यह भी आहार प्रेरित मोटापे में ग्लूकोज चयापचय का अनियंत्रण की जांच करने के लिए इस पद्धति लागू होता है। यह रक्त संग्रह विधि ग्लूकोज और लिपिड चयापचय और एक मानव रोग मॉडल जीव के रूप zebrafish के उपयोग में वृद्धि होगी जो hematological अध्ययन, सहित कई अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देगा।
Introduction
उनके अंगों और आनुवंशिकी मनुष्य 1,2 के उन लोगों के लिए समान हैं क्योंकि Zebrafish मानव रोगों की एक मूल्यवान मॉडल के रूप में बढ़ती लोकप्रियता प्राप्त कर रहे हैं। विकास जीव विज्ञान के क्षेत्र में, कई अध्ययनों zebrafish और मानव शो hematopoiesis 3, रक्तस्तम्भन 4,5, और myelopoiesis 6 में समानता चिह्नित किया है कि प्रदर्शन किया है। वयस्क zebrafish भी इस मॉडल जीव शेयरों क्योंकि मानव रोगों में बाधित उन लोगों के साथ आम रास्ते प्रतिरक्षात्मक 7, neurodegenerative 8 और मोटापे से संबंधित रोगों 9 के अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। मोटापा और मोटापे से संबंधित रोगों (मधुमेह, यकृत स्टीटोसिस और nonalcoholic स्टीटोहैपेटाइटिस और atherosclerosis), के लिए zebrafish रक्त ग्लूकोज और लिपिड के स्तर को अच्छी तरह से कई ट्रांसजेनिक और आहार प्रेरित मोटापा मॉडल 10-13 में जांच की गई है।
अलग-अलग जानवरों से बार-बार रक्त नमूने पशु का उपयोग और दिसम्बर कम हो जाएगाinterindividual मतभेद rease। हालांकि, कई बार नमूना संग्रह क्योंकि उनके अपेक्षाकृत छोटे रक्त की मात्रा और आसानी से सुलभ जहाजों की कमी की वजह से इस तरह के zebrafish के रूप में छोटे जानवरों में तकनीकी रूप से कठिन है। इन तरीकों मारक सहित उनके ही कमियां है, हालांकि zebrafish से एक समय रक्त संग्रह के लिए कई तरीकों, जुड़े ऊतकों को नुकसान और सीमित रक्त की मात्रा विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, 1-5 μl रक्त पृष्ठीय महाधमनी 5 के क्षेत्र में लंबाई में लगभग 0.3 सेमी की एक पार्श्व चीरा से काटा जा सकता है। कवच की करधनी के माध्यम से काटने से कैंची से कत्ल 5-10 μl रक्त 10 जमा कर सकते हैं। एक और सुविधाजनक रक्त नमूने विधि पूंछ पृथक 14 है। कार्डियक पंचर एक ही मछली से बार-बार रक्त संग्रह के लिए एक संभावित वैकल्पिक तरीका है, लेकिन बहुत ही छोटी राशि इस प्रक्रिया के साथ (लगभग 50 NL) प्राप्त कामकाज हो सकता है कि विश्लेषण की संख्या की सीमा11 मेड। तदनुसार, एक नए प्रोटोकॉल इस जीव मानव रोगों के लिए एक मानक मॉडल जीव होने के लिए एक महत्वपूर्ण अग्रिम आवश्यक होगा जो दोहराया गैर घातक रक्त नमूने, सक्षम करने के लिए आवश्यक है। इस तकनीक को औषधीय प्रतिक्रिया, आणविक निदान के लिए बायोमार्कर, रोग का निदान के निर्धारण की खोज की है, और इस तरह के चयापचय रोगों, अपक्षयी रोगों तथा कैंसर के कई प्रकार के रूप में विभिन्न रोगों की निगरानी के परीक्षण के लिए अनुमति होगी।
इसलिए हम zebrafish क्रमानुसार 15 से रक्त प्राप्त करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव विधि विकसित की है। यहाँ हम नेत्रहीन प्रक्रिया का प्रदर्शन और इस तकनीक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस विधि का उपयोग करना, विभिन्न हीमोग्लोबिन सहित पैरामीटर, रक्त ग्लूकोज उपवास, और स्वस्थ वयस्क zebrafish के रक्त में लिपिड के आधार पर सामान्य मूल्य का मूल्यांकन किया गया। इसके अतिरिक्त, हम भी इस विधि मीटर से धारावाहिक के नमूने की आवश्यकता है कि अध्ययन के लिए उपयुक्त है या नहीं का मूल्यांकनoverfeeding प्रयोगों के दौरान रक्त शर्करा के स्तर में अस्थायी परिवर्तन onitoring।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम क्रमानुसार वयस्क zebrafish से रक्त प्राप्त करने के लिए यहां एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस विधि को बाहर ले जाने के लिए सरल है और हम एक दैनिक आधार पर प्रयोगशाला में इस्तेमाल करते हैं। यह रक्त संग्रह व?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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