Ripetuto il prelievo di sangue per esami del sangue in Zebrafish adulti
Summary
Repeated blood sampling is necessary and important in animal research. We developed a novel, non-lethal and reliable method for repeated blood collection from adult zebrafish, and applied this method to the study of blood biochemistry, including glucose metabolism.
Abstract
Raccolta del sangue ripetuta è una delle tecniche più comuni eseguiti su animali da laboratorio. Tuttavia, non è stato stabilito un protocollo non letale per la raccolta del sangue da zebrafish. I metodi precedenti per la raccolta del sangue da zebrafish sono letali, come incisione laterale, decapitazione e la coda di ablazione. Così abbiamo sviluppato un metodo di raccolta del sangue "ripetuto" romanzo, e qui presenti un protocollo dettagliata che illustra questa procedura. Questo metodo è minimamente invasiva e comporta un tasso di mortalità molto basso (2,3%) per zebrafish, consentendo campionamento ripetuto sangue dello stesso individuo. Il volume massimo di prelievo di sangue dipende dal peso corporeo del pesce. Il volume per ripetuti prelievi di sangue a intervalli dovrebbe essere ≤0.4% del peso corporeo ogni settimana o ≤1% ogni 2 settimane, che sono stati valutati da misurazioni di emoglobina nel sangue. Inoltre, l'emoglobina, glicemia a digiuno, trigliceridi del plasma (TG) e totale eclivelli holesterol in zebrafish adulti maschili e femminili sono stati misurati. Abbiamo applicato anche questo metodo per studiare la disregolazione del metabolismo del glucosio a obesità indotta dalla dieta. Questo metodo di raccolta del sangue consentirà numerose applicazioni, tra cui metabolismo glucidico e lipidico e gli studi ematologiche, che consentirà di aumentare l'uso di zebrafish come un modello di malattia umana organismo.
Introduction
Zebrafish stanno guadagnando crescente popolarità come un modello valido di malattie umane perché i loro organi e genetica sono simili a quelli degli esseri umani 1,2. Nel campo della biologia dello sviluppo, molti studi hanno dimostrato che il pesce zebra e spettacolo umano contrassegnati somiglianza in ematopoiesi 3, emostasi 4,5, e mielopoiesi 6. Zebrafish adulti sono utilizzati anche per lo studio immunologico 7, 8 e le malattie neurodegenerative legate all'obesità 9 perché questo modello azioni organismo percorsi comuni con quelli perturbato in malattie umane. Per l'obesità e le malattie connesse con l'obesità (diabete, steatosi epatica non alcolica e e aterosclerosi steatoepatite), zebrafish glucosio nel sangue e livelli di lipidi sono state investigate esaurientemente in vari modelli transgenici obesità e dieta-indotta 10-13.
Ripetuto prelievo di sangue da singoli animali riduce il consumo animale e dicembrerease differenze interindividuali. Tuttavia, la raccolta dei campioni ripetuto è tecnicamente difficile in piccoli animali come zebrafish causa della loro relativamente piccolo volume di sangue e la mancanza di navi facilmente accessibili. Sono stati sviluppati diversi metodi per un tempo di raccolta del sangue da zebrafish, anche se questi metodi hanno i loro inconvenienti, tra cui letalità, danno tissutale associato e il volume di sangue limitata. Ad esempio, 1-5 microlitri di sangue può essere raccolto da un'incisione laterale di circa 0,3 cm di lunghezza nella regione della aorta dorsale 5. Decapitazione con le forbici tagliando attraverso la cintura pettorale può raccogliere 5-10 microlitri di sangue 10. Un altro comodo metodo di campionamento del sangue è la coda di ablazione 14. Puntura cardiaca è una potenziale metodo alternativo per la raccolta di sangue ripetuto da uno stesso pesce, ma la piccola quantità ottenuta (circa 50 nl) con questa procedura limita il numero di analisi che possono essere effetmed 11. Di conseguenza, è necessario un nuovo protocollo per consentire ripetuto prelievo di sangue non letale, che sarebbe un progresso critica necessaria per questo organismo sia un organismo modello standard per le malattie umane. Questa tecnica consentirebbe di testare risposta farmacologica, la scoperta di biomarcatori molecolari per la diagnosi, la determinazione della prognosi e il monitoraggio di varie malattie, come le malattie metaboliche, malattie degenerative e diversi tipi di tumori maligni.
Abbiamo quindi sviluppato un metodo minimamente invasivo per ottenere sangue da zebrafish in serie 15. Qui mostriamo la procedura visivamente e fornire un protocollo dettagliato per questa tecnica. Con questo metodo, il valore normale in base a vari parametri, tra cui l'emoglobina, glicemia a digiuno, e lipidi nel sangue di zebrafish adulti sani sono stati valutati. Inoltre, abbiamo anche valutato se questo metodo è adatto per gli studi che richiedono campioni di serie di mONITORAGGIO i cambiamenti temporali nei livelli di glucosio nel sangue durante gli esperimenti sovralimentazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presentiamo qui un protocollo dettagliato per l'ottenimento in serie sangue di zebrafish adulto. Questo metodo è semplice da effettuare e lo usiamo in laboratorio su base giornaliera. Questo metodo di raccolta del sangue si basa sull'inserimento di un capillare ago di vetro in aorta dorsale del pesce zebra. Durante questa procedura, è fondamentale stare attenti a non asportare la colonna vertebrale, perché è il criterio per la ricerca per l'aorta dorsale. Ridurre il lesioni alla colonna vertebrale mig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by JSPS KAKENHI Grant Number 25860294 and 25590073. We would like to thank Ms. Yui Namie for the hand-drawn illustration, and Mr. Koshi Kataoka and Ms. Sayuri Ichikawa for assistance with the zebrafish maintenance.
Materials
| Glass capillaries with filament | Narishige | GD-1 | 1.0-mm-outer-diameter. |
| Needle puller | Narishige | PC-10 | To produce the needls |
| Heparin | Wako Pure Chemical Industries | 081-00136 | For heparinization |
| Aspirator tube assembly | Drummond | 2-040-000 | For blood collection |
| Bulb dispenser | Drummond | 1-000-9000 | For blood collection |
| 2-phenoxyethanol | Wako Pure Chemical Industries | 163-12075 | For anesthetizing the fish |
| DRI-CHEM3500V | Fujifilm | – | For hemoglobin measurement |
| DRI-CHEM Slides | Fujifilm | Hb-WII | For hemoglobin measurement |
| Glutest Neo Super | Sanwa Kagaku Kenkyusho | – | For bood glucose measurement |
| Wako L-type TG kit | Wako Pure Chemical Industries | 464-44201 | For TG measurement |
| Wako L-type CHO kit | Wako Pure Chemical Industries | 460-44301 | For total cholesterol measurement |
| Parafilm M | Alcan Packaging | PM996 | To expel the blood on |
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