रीयल टाइम में anaesthetized चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी द्वारा Mesenteric रगों में न्यूट्रोफिल और monocytes इमेजिंग
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
कुशल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया संक्रमण या चोट की साइट के लिए रक्त ल्यूकोसाइट्स का तेजी से लामबंदी पर निर्भर है। Vivo में ल्युकोसैट प्रवास की जांच कर संवहनी अन्तःचूचुक साथ ल्युकोसैट transendothelial प्रवास और बातचीत के आणविक आधार को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। एक शक्तिशाली दृष्टिकोण ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी शामिल है।
यहाँ हम एक औंधा confocal खुर्दबीन के साथ नारंगी डाई लेबल न्यूट्रोफिल इंजेक्शन के साथ CX 3 CR1 GFP / गुम्मट माउस चतुर्थ में इमेजिंग monocytes और जीवाणुओं के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। समय चूक फिल्मों दोनों स्थिर राज्य और भड़काऊ शर्तों के तहत mesenteric रगों में ल्युकोसैट व्यवहार के विश्लेषण की अनुमति इमेजिंग के कई घंटे के लिए 30 मिनट से एकत्र हुए। स्थानीय स्तर पर TLR2 / TLR1 एगोनिस्ट Pam3SK4 साथ रक्त वाहिनियों की सूजन पैदा और subseque नजर रखने के लिए हम भी कदम का वर्णनन्यूट्रोफिल और monocytes के NT भर्ती।
प्रस्तुत तकनीक भी ल्यूकोसाइट्स की अन्य आबादी की निगरानी और अन्य उत्तेजनाओं या ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग ल्युकोसैट भर्ती या तस्करी में फंसा अणुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
न्यूट्रोफिल और monocytes लगातार रक्त में प्रसारित कि सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं रहे हैं। चोट या संक्रमण होने पर भड़काऊ संकेतों के साथ साथ एक सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1-3 की शुरुआत, क्षतिग्रस्त और संक्रमित ऊतकों में ल्युकोसैट diapedesis प्रेरित। ल्युकोसैट लामबंदी की तेज़ी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के सकारात्मक परिणाम को निर्धारित करता है। ये जटिल प्रक्रियाओं ल्युकोसैट में फंसा अणुओं पर अंतर्दृष्टि प्राप्त .To घूम ल्यूकोसाइट्स और अन्तःचूचुक 1-3 के बीच चिपकने वाला संपर्कों की स्थापना के लिए है कि मदद सूजन अन्तःचूचुक पर उपस्थित विशिष्ट अणु (जैसे, selectins, अन्तःचूचुक बाध्य chemokines) पर भरोसा भर्ती झरना, यह सेल भर्ती के कैनेटीक्स कल्पना करने के लिए और प्रत्येक कोशिका / आबादी के व्यवहार पर नज़र रखने के लिए महत्वपूर्ण है। एक प्रभावी तरीका ब्याज की कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ट्रांसजेनिक चूहों पर intravital माइक्रोस्कोपी शामिल है।
तिथि करने के लिए सामग्री ">, intravital माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कई दृष्टिकोण छवि के लिए विकसित किए गए वाहिका 4,5। उदाहरण के लिए, कान डर्मिस वाहिका या intravital confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा mesenteric नसों की इमेजिंग murine Ly6C कम monocytes और मानव की गश्त व्यवहार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था CD14 स्थिर राज्य की स्थिति को 6-8 के तहत रक्त वाहिकाओं के ल्यूमिनल तरफ CD16 + monocytes मंद। माउस cremaster वाहिका मॉडल अक्सर ट्रांसजेनिक चूहों में सूजन या इस्कीमिक की शर्तों के तहत न्यूट्रोफिल या भड़काऊ Ly6C उच्च monocytes के व्यवहार पर नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। उस में मामले, cremaster IL1β, CCL2, TNFβ या FMLP की intrascrotal इंजेक्शन के माध्यम से प्रेरित है। 2-4 घंटे के बाद, ऊतकों तो शल्य चिकित्सा exteriorized कर रहे हैं और intravital confocal माइक्रोस्कोपी 9-11 से विश्लेषण किया।निम्नलिखित प्रोटोकॉल किसी के साथ एक ही समय में monocytes और जीवाणुओं की निगरानी के लिए एक विधि का वर्णनउल्टे प्रतिदीप्ति confocal खुर्दबीन। इसके अलावा, हमारे विधि ल्युकोसैट भर्ती के कैनेटीक्स का पालन करने के लिए कैसे से पहले छवि एक ही पोत (स्थिर अवस्था हालत) के लिए और सूजन के बाद और विवरण कैसे। इस उद्देश्य के लिए, हम जिसका monocytes EGFP व्यक्त करते हैं, चतुर्थ एक नारंगी डाई लेबल murine न्यूट्रोफिल इंजेक्शन के साथ CX 3 CR1 GFP / गुम्मट माउस का उपयोग करें। एक औंधा confocal खुर्दबीन का उपयोग करना, यह (1) को ट्रैक और स्थिर राज्य की स्थिति और (2) स्थानीय सूजन के बाद एक ही बर्तन में दोनों monocytes और जीवाणुओं की भर्ती का पालन करने के तहत गश्त Ly6C कम monocytes का विश्लेषण करने के लिए संभव है। यहाँ हम TLR2 / TLR1 एगोनिस्ट Pam3CSK4 12 का उपयोग करके भड़काऊ शर्तों पैदा करते हैं। इसके अलावा, ऐसे इमेजिंग विशिष्ट नाक आउट चूहों पर या अवरुद्ध एंटीबॉडी 6,9,13 की उपस्थिति में प्रदर्शन करता है, तो ल्युकोसैट भर्ती झरना के विभिन्न चरणों में हित के विशिष्ट अणुओं की भूमिका निर्धारित करने के लिए मदद मिल सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में वर्णित तरीके कुशलता से स्थिर राज्य और भड़काऊ शर्तों के तहत mesenteric रगों में एककेंद्रकश्वेतकोशिका और न्युट्रोफिल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक सुसंगत दृष्टिकोण प्रदान करते हैं।
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
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