Воображение нейтрофилов и моноцитов в брыжеечных вен Прижизненное микроскопии на наркотизированных мышей в реальном времени
Summary
We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.
Abstract
Эффективное иммунный ответ зависит от быстрой мобилизации лейкоцитов крови к месту инфекции или травмы. Исследуя миграцию лейкоцитов в естественных условиях имеет решающее значение для понимания молекулярной основы лейкоцитов трансэндотелиальной миграции и взаимодействия с сосудистого эндотелия. Один мощный подход предполагает прижизненный микроскопии на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках интерес.
Здесь мы приводим протокол для визуализации моноцитов и нейтрофилов в CX 3 CR1 GFP / мас мыши IV введенного с оранжевыми красителя помечены нейтрофилов с инверсной конфокальной микроскопии. Покадровой фильмы собрались от 30 мин до нескольких часов визуализации позволяют анализировать поведение лейкоцитов в брыжеечных вен под обеих стационарных и воспалительных состояний. Мы также описать шаги, чтобы побудить локально судно воспаление крови с TLR2 / TLR1 агониста Pam3SK4 и контролировать subsequeнт набор нейтрофилов и моноцитов.
Представленная методика может также использоваться для мониторинга других популяций лейкоцитов и исследовать молекулы, замешанных в лейкоцитов или торговли, используя другие стимулы или трансгенных мышей.
Introduction
Нейтрофилов и моноцитов в клетки врожденной иммунной системы, которые непрерывно циркулируют в крови. После травмы или инфекции, воспалительные сигналы вызывают лейкоцитов диапедез в поврежденные и инфицированные ткани, в данном инициирования клеточного иммунного ответа 1-3. Быстрота мобилизации лейкоцитов определяет положительный результат иммунных реакций. Эти сложные процессы зависят от специфических молекул (например, Селектины, эндотелий-хемокинов связаны), присутствующих на воспаленной эндотелия, которые помогают для создания липких контактов между циркулирующих лейкоцитов и эндотелия 1-3 .Чтобы получить представление о молекулах, участвующих в лейкоцитарной кадровое каскада, важно, чтобы визуализировать кинетику набора клеток, а также отслеживать поведение каждой клеточной популяции /. Эффективным методом прижизненной микроскопии включает на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках, представляющих интерес.
Содержание "> На сегодняшний день, несколько подходов с использованием прижизненной микроскопии были разработаны для изображения сосудистой 4,5. Например, визуализация уха дермы сосудистой или брыжеечных вен прижизненной конфокальной микроскопии был использован для определения поведения патрулирования мышиный Ly6C низких моноцитов и человека CD14 + CD16 тусклым моноциты на стороне просвета кровеносных сосудов в стационарных условиях 6-8. Сосудистая мышиная модель кремастер часто используется для наблюдения за поведением нейтрофилов или воспалительных Ly6C высоких моноцитов при воспалительных или ишемических состояний у трансгенных мышей. В том, что так, кремастер стимулируется с помощью внутримошоночной инъекции IL1β, CCL2, TNFβ или ФМЛФ. После 2-4 часов, затем ткани хирургическим выводили и проанализированы прижизненной конфокальной микроскопии 9-11.Следующий протокол описывает метод мониторинга моноцитов и нейтрофилов в то же время с любымперевернутый флуоресцентной конфокальной микроскопии. Кроме того, наш метод подробно описано, как изображение и тот же сосуд раньше (стационарный режим) и после воспаления и, как следовать кинетики лейкоцитов. Для этой цели мы используем CX 3 CR1 GFP / вес мыши, чей моноциты экспрессируют EGFP, вводили IV с оранжевым красителем мышиных нейтрофилов помечены. С использованием инвертированного конфокальной микроскопии, можно (1) для отслеживания и анализа патрулирование Ly6C низкие моноциты в стационарных условиях и (2), чтобы следовать набору обоих моноцитов и нейтрофилов в том же сосуде после местного воспаления. Здесь мы создаем воспалительных заболеваний с помощью агониста TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Кроме того, такие изображения могут помочь определить роль специфических молекул, представляющих интерес в различных этапах лейкоцитов каскада если осуществляется на определенных нокаут-мышей, или в присутствии блокирующих антител 6,9,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методологии, описанные в этой рукописи обеспечить последовательный подход, чтобы эффективно изучить моноцитов и нейтрофилов в поведение брыжеечных вен в стационарных и воспалительных состояний.
Решающим шагом в подготовке является иммобилизация кишечника с PBS, конта?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.
Materials
| 5 mL polystyrene round bottom tubes | Beckton Dickinson | 352058 | |
| 10x CFI Plan Apochromat 0.45 DT:4mm | Nikon | ||
| 20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm | Nikon | ||
| Cell Tracker Orange CMRA Dye | Life Technologies | C34551 | |
| EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | Stem Cell Technologies | 19762 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| FCS | PAA | A15-042 | |
| Immersion Oil Type A | Nikon | any viscous oil | |
| Life Box Temperature Control System | Life Imaging | ||
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NH4Cl | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon | A1R | inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software |
| PBS | Life Technologies | D8537 | |
| phenol red free DMEM/F12 | Life Technologies | 21041-025 | any phenol red free medium is suitable |
| PAM3CSK4 | Invivogen | tlrl-pms | reconstitute in PBS |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit | |
| tissue culture dish 100 | TPP | 93100 |
References
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
- Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
- Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
- Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
- Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
- Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
- Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
- Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
- Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
- Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
- Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
- Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109 (2011).
