Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca²⁺ In Aged neuroni dell'ippocampo

Summary

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Abstract

Suscettibilità alla morte cellulare dei neuroni associati alla neurodegenerazione e ischemia sono estremamente aumentata nel cervello invecchiato ma meccanismi responsabili sono mal noti. Eccitotossicità, un processo che si ritiene di contribuire al danno dei neuroni indotta da entrambe le ingiurie, è mediata da attivazione dei recettori del glutammato che promuove Ca ²⁺ afflusso e mitocondriale sovraccarico di Ca ^2+. Un cambiamento sostanziale intracellulare di Ca ²⁺ omeostasi o ristrutturazione di ^Ca2 + intracellulare omeostasi può favorire danno neuroni in vecchi neuroni. Per indagare Ca ²⁺ rimodellamento nell'invecchiamento abbiamo usato l'imaging cellulare dal vivo in colture a lungo termine di neuroni di ratto dell'ippocampo che assomigliano per alcuni aspetti neuroni in vivo di età. Per questo fine, cellule dell'ippocampo sono, in primo luogo, al momento disperso dalle nuove ippocampi di ratto nato e placcato su vetrini rivestiti, vetro poli-D-lisina. Poi culture sono tenuti in media controllati per diversi giorni o più weeks per indagare giovani e vecchi neuroni, rispettivamente. In secondo luogo, neuroni in coltura sono caricati con fura2 e sottoposti a misure di concentrazione citoplasmatica di Ca ²⁺ utilizzando digitale rapporto imaging di fluorescenza. In terzo luogo, neuroni in coltura sono trasfettate con plasmidi che esprimono un tandem di bassa affinità equorina e GFP mirata ai mitocondri. Dopo 24 ore, equorina all'interno delle cellule viene ricostituito con coelenterazine e neuroni sono sottoposti ad immagini bioluminescenza per il monitoraggio della concentrazione di ^Ca2 + mitocondriale. Questa procedura in tre fasi permette di monitorare citosolica e mitocondriale Ca ²⁺ risposte agli stimoli rilevanti come ad esempio l'agonista del recettore del glutammato NMDA e confronta se queste ed altre risposte sono influenzati da invecchiamento. Questa procedura può produrre nuove intuizioni su come l'invecchiamento influenza citosolica e mitocondriale risposte Ca ²⁺ agli stimoli selezionati, nonché la sperimentazione di farmaci selezionati volti a prevenire cella neuronemorte in malattie legate all'età.

Introduction

Eccitotossicità è uno dei meccanismi più importanti che contribuiscono a danno neuronale e la morte cellulare in insulti neurologici quali ischemia, e in alcune malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer ^1. Questo tipo di neurotossicità è mediato principalmente da glutammato agisce su Ca ²⁺ -permeable, recettori ionotropici NMDA (NMDAR) ^2. L'esposizione di neuroni in coltura per il glutammato può portare a eccitotossicità ^3, che provoca l'apoptosi neuronale ^4. Noi e altri abbiamo già riferito che la vulnerabilità neuronale all'apoptosi NMDA indotta può cambiare con lo sviluppo in vitro e l'invecchiamento ^5-8.

È ampiamente accettato che un aumento del libero citosolico Ca ²⁺ concentrazione ([Ca ^2+] _cyt) porta all'attivazione cellule. Tuttavia, se questo aumento è troppo alta e / o di sostegno sufficientemente, può innescare la morte cellulare ^9. Inoltre, è stato propostoeccitotossicità che richiede Ca ²⁺ mitocondriale assorbimento ^10, poiché il trattamento con neuroni neuroni protette contro disaccoppiatore mitocondriale indotta da glutammato morte cellulare ^11. Se mitocondri occupano troppo Ca ^2+, l'apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale può verificarsi, che porta al rilascio del citocromo c ed altri fattori pro-apoptotica, e inducendo apoptosi. Abbiamo recentemente dimostrato che questo mitocondriale Ca ²⁺ assorbimento è direttamente correlata alla suscettibilità età-dipendente per eccitotossicità, misurando direttamente NMDA indotta mitocondriale Ca ²⁺ uptake in singoli neuroni ippocampali ^5, un metodo che viene riportato in questo articolo. L'ippocampo, coinvolto in processi fisiologici, come l'apprendimento, la memoria e altri processi cognitivi ^12, è altamente vulnerabile a invecchiamento e malattie neurodegenerative ^13. E 'stato proposto che, dopo diverse settimane in vitro, coltaneuroni ippocampali mostrano una serie di caratteristiche tipiche di neuroni ^dai 14. Di conseguenza, colture di neuroni dell'ippocampo a lungo termine possono fornire un modello globale per indagare Ca ²⁺ meccanismi mediata di una maggiore eccitotossicità nell'invecchiamento.

L'obiettivo generale del metodo presentato è, quindi, di indagare i cambiamenti sostanziali nel intracellulare di Ca ²⁺ omeostasi o Ca ²⁺ rimodellamento nel cervello di invecchiamento tra cui il differenziale Ca ²⁺ risposte indotte da agonisti del recettore NMDA in una prospettiva a lungo termine colture di neuroni dell'ippocampo . Il metodo comprende una descrizione dettagliata della cultura di neuroni ippocampali di ratto e il monitoraggio di citosolici e mitocondriali Ca ²⁺ concentrazioni da fluorescenza e l'imaging bioluminescenza in singoli neuroni rispettivamente. Imaging di fluorescenza di citosoliche Ca ²⁺ in neuroni in coltura è una procedura standard. Tuttavia, questo metodo è meno affidabile per subcellulare Ca ²⁺ misure tra cui mitocondriale Ca ^2+. Le ragioni di questa includono la mancanza di una corretta mirati sonde sintetiche e affinità inadeguato per ^Ca 2 + concentrazioni che possono cambiare nei mitocondri dal livello di micron basso anche per il livello di mm. L'utilizzo di Ca ²⁺ sonde a base di proteine ​​come ad esempio equorina, ha permesso di organelli subcellulari di targeting e l'utilizzo di derivati ​​diversi Ca ²⁺ affinità utilizzando diversi coelenterazines o sonde mutanti privi specifico Ca ²⁺ siti di legame ^15. In questo modo, bioluminescenza di cellule che esprimono equorina mitocondri mirati può consentire il monitoraggio dei mitocondriali di Ca ²⁺ concentrazioni in singoli neuroni. Tuttavia, questa procedura può richiedere l'uso di macchine fotografiche di conteggio di fotoni o telecamere CCD ultrasensibili per bioluminescenza ^16-18. Questo metodo può produrre nuovi risultati che dovrebbero essere confermata in più establmodelli mentata invecchiamento del cervello come, ad esempio, fette di cervello da vecchi animali.

Protocol

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati trattati secondo protocolli approvati dalla struttura alloggiativa animale Valladolid University in accordo con la Convenzione europea 123 / Consiglio d'Europa e la direttiva 86/609 / CEE. 1. Breve e Lungo Periodo Cultura di ratto neuroni dell'ippocampo Preparazione di poli-D-lisina rivestito, 12 coprioggetto mm vetro. Sterilizzare 12 mm di diametro vetrini in etanolo per almeno 24 ore. Lasciarli asciuga…

Representative Results

Qui si descrive un metodo semplice per valutare Ca 2+ rimodellamento e gli effetti di NMDA sulla citosolica e mitocondriale [Ca 2+] nei neuroni età. La figura 1 mostra lo schema del procedimento per l'isolamento e la coltura neuroni ippocampali di ratti neonati. Prima di iniziare, abbiamo bisogno di preparare sterili, rivestiti, vetrini poli-D-lisina e localizzarli in un piatto 4-bene. Poi, ratti neonati vengono uccisi e il cervello rimossi. Dopo aver isolato l'ippocampo, …

Discussion

La ristrutturazione di Ca ²⁺ intracellulare omeostasi nel cervello che invecchia è stata collegata alla perdita cognitiva, aumentata suscettibilità alle ischemico danni, eccitotossicità e neurodegenerazione. Per studiare questa ipotesi in vitro, le procedure di imaging Ca ²⁺ sono disponibili. Purtroppo, colture vitali di vecchi neuroni dell'ippocampo non sono affidabili. Recentemente, è stato osservato che le culture a lungo termine di ratto hippocampal neuroni presenti molte delle…

Materials

Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics