利用单感器记录技术检测臭虫嗅觉神经元对化学信号物质的电生理反应

摘要

臭虫依靠其触角嗅觉感受器中的嗅觉受体神经元来探测环境中的化学信号物质。通过单感受器记录技术，我们展示了一种评估臭虫对化学信号物质反应的方法，并探讨了其中涉及的编码过程。

摘要

昆虫的嗅觉系统在探测环境中化学信号分子方面起着重要作用。特别是触角上的嗅觉感受器，其内部包含一个或多个神经元，被认为是响应化学刺激的主要结构。通过在刺激暴露后直接记录嗅觉感受器中的动作电位，单感受器记录（SSR）技术为研究昆虫对化学刺激的神经反应提供了一种强有力的手段。对于臭虫这一臭名昭著的人体寄生虫，已鉴定出多种类型的嗅觉感受器。在本研究中，我们利用SSR方法展示了臭虫嗅觉感受器对两种化学刺激物的神经反应，以及对其中一种刺激物的剂量依赖性反应。该方法使研究人员能够对作用于臭虫嗅觉感受器的单个化学刺激物进行早期筛选，从而为开发新型臭虫引诱剂或驱避剂提供有价值的信息，并有助于推动臭虫防控工作。

引言

常见的床虱 Cimex lectularius L（半翅目：臭虫科）是一种暂时性体外寄生虫，属于专性吸血昆虫，其生存、发育和繁殖需要从包括人类和动物在内的宿主身上获取血液资源^1,2。尽管目前极少有因 C. lectularius 引起病毒传播的报道，但其叮咬所造成的困扰在生理和心理上均对宿主产生严重影响³。化学杀虫剂的引入和广泛使用，特别是滴滴涕（DDT）的应用，曾显著降低了床虱侵扰的风险，到20世纪50年代末，侵扰水平已降至不再被视为严重公共卫生问题的程度。然而，多种潜在因素导致了全球范围内床虱种群的重新暴发，例如杀虫剂使用减少、公众防范意识下降、旅行活动增加以及对杀虫剂抗性的产生^4-9。

昆虫通过触角和下颚须等嗅觉器官来检测和识别环境中的化学信号。昆虫触角上的嗅觉感器在检测这些化学信号中起着关键作用。化学分子通过表皮表面的孔隙进入触角表皮。触角淋巴液中的气味结合蛋白与这些化学分子结合，并将其转运至气味受体¹⁰。气味受体及其共受体在神经膜上形成非选择性阳离子通道，当气味受体识别这些化学分子后，该通道将发生去极化¹¹。

单感器记录技术（SSR）用于检测施加化学或非化学刺激后动作电位在细胞外发生的变化。通过将记录电极插入感器淋巴液中，同时将参考电极插入昆虫身体的其他部位（通常为复....

方案

1. 实验仪器、刺激溶液及臭虫的准备

1. 配制50% KNO₃溶液₂ 溶液（w/v）置于20 ml瓶中。
2. 将两根钨微电极在 KNO₃ 中 sharpen₂ 以5 V电压通过反复将钨电极浸入和抽出溶液来处理溶液。
   1. 通过将约10 mm长的钨丝反复浸入熔融的KNO₃中，对其进行粗略打磨。₂ 以每秒2次浸入的速度将溶液处理 约5分钟，这会极大地消耗钨丝的前端。
   2. 通过以每秒2次的频率将金属丝尖端约1 mm部分浸入并抽出溶液，精细地 sharpen 电极 至少 1 分钟 以便使电极尖端细而锐利。在显微镜下频繁检查电极尖端直径，直至达到0.2–0.5 µm，此尺寸足以刺穿臭虫嗅觉感器的角质层。
      注意：手动打磨电极时，钨丝浸入 KNO₃ 溶液的速度应保持缓慢且稳定。₂ 溶液的流速并非始终恒定。随着操作熟练度的提高，更容易在电极尖端打磨过程中保持相对恒定的速度。打磨时间也不确定，具体取决于所需电极的精细程度。此处，电极尖端直径约为0.2 µm即足以刺入嗅觉感器。
3. 将每种化学刺激物用二甲基亚砜（DMSO）从纯化合物稀释至1:10 v/v的初始浓度，作为储备液。根据实验所需的剂量数量，再用DMSO对每种化学物质的储备液进行系列十倍稀释。此处使用10% (+)-β-蒎烯和桉叶素。
....

结果

单感器记录是一种强大的研究技术，广泛应用于昆虫化学生态学与神经生理学研究。通过研究昆虫对不同挥发性化合物的神经反应，尤其是那些被认为在生态上与昆虫生存和发育相关的化合物，不仅能够为我们深入了解昆虫嗅觉过程提供宝贵的信息，还可能开辟新的研究途径，有望推动开发出用于害虫防治的新型有效试剂。

作为一种臭名昭著的城市害虫，臭虫无疑吸引了众多研究人员的关注。在与臭虫相关的各类研究领域中，其嗅觉机制对于臭虫的化学生态学具有至关重要的意义。以往的研究已明确描述了不同类型嗅觉感器在臭虫触角上的数量与分布情况。如图2A所示，臭虫的触角由四个节段组成（SC、PE、F1 和 F2）。大多数嗅觉感器分布于第二鞭节（F2）的后端，但不同类型感器的分布模式明显不同：D型感器（即 Dα、Dβ 和 Dγ）仅位于触角内侧（图2C），而 C 型以及 E 型（E1 和 E2）感器则分布在触角两侧（图2B

讨论

单感器记录技术已广泛用于检测果蝇、蚊子和床虱等昆虫对环境中不同化学刺激物的神经反应。这些化学刺激物通常溶解并稀释于一种常用溶剂中，以配制不同浓度的处理溶液。然而，不同溶剂可能导致刺激物释放速率存在显著差异。以往对某些研究较为深入的昆虫的研究表明 黑腹果蝇, Anopheles gambiae, 致倦库蚊 和 Aedes aegypti 有 通常使用石蜡油作为溶剂来溶解刺激物，因为这些昆虫对石蜡油相对不敏感^17-20石蜡油也曾在早期的臭虫单感器记录研究中使用，原因相同。¹⁴然而，最常用的溶剂未必对每种昆虫都最适宜。以床虫为例，在不同的研究中，均使用了石蜡油和DMSO来溶解刺激物，而床虫对这两种溶剂也表现出不敏感性。^14,15但相同剂量的刺激物溶解于DMSO时，对臭虫感受器的神经反应明显更强。例如，溶解于DMSO的R-(+)-柠檬烯和S-(-)-柠檬烯可使臭虫触角Dγ感受器产生≥70次/秒的神经放电反应，而溶解于石蜡油的柠檬烯仅引起Dγ感受器≤25次/秒的神经反应。这种神经反应减弱的现象.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钨丝	A-M SYSTEMS	#716500	用于制备电极
KNO₂	Sigma	#310484	用于打磨钨丝
交流电源	BK Precision	1653A	为打磨钨丝提供电压
Leica Z6 APO 显微镜	Leica	10447424	用于观察触角上的感觉器
刺激控制器	Syntech	CS-55	用于控制刺激施加
4通道USB信号采集控制器	Syntech	IDAC-4	记录前和记录期间所有信号的实时屏幕显示
光源	SCHOTT	A20500	为观察提供照明
显微操作器	Leica	115378	用于微调电极位置
扬声器	Juster	95a	连接至信号采集控制器IDAC-4，用于输出信号声音
磁力支架	Narishige	GJ-1	用于固定参考电极、固定臭虫以及刺激递送管
TMC 振动隔离台	TMC	63-500	用于隔离设备振动
盖玻片	Tedpella	2225-1	用于固定臭虫
双面胶带	3M	XT6110	用于将臭虫固定在盖玻片上
牙科蜡	Dentakit	DK-R012	用于支撑固定臭虫的盖玻片