By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.
Brug af kyllingefostre er det muligt direkte at afprøve virkningerne af enten vækstfaktorer eller specifikke inhibitorer af signalveje på genekspression og aktivering af signaltransduktionsveje. Denne teknik tillader levering af signalmolekyler på præcist definerede udviklingsstadier til bestemte tidspunkter. Herefter embryoner kan høstes og genekspression undersøges, for eksempel ved in situ hybridisering eller aktivering af signaltransduktionsveje observeret med immunfarvning.
I denne video heparin perler lægges i blød i FGF18 eller AG 1-X2 perler gennemvædet med U0126, en MEK-inhibitor, er podet ind i lem opløbet in ovo. Dette viser, at FGF18 inducerer ekspression af MyoD og ERK phosphorylering og både endogene og FGF18 induceret MyoD ekspression inhiberes af U0126. Perler gennemvædet i en retinsyre antagonist kan forstærke tidlig MyoD-induktion af FGF18.
Denne fremgangsmåde kan være osed med en lang række forskellige vækstfaktorer og inhibitorer og er let tilpasses til andre væv i udviklende embryo.
Avian embryoner har givet et stærkt værktøj til undersøgelse af udviklingen i mange år 1. En af deres mest nyttige egenskaber er, at de er relativt let at manipulere. Ekstern udvikling gør det muligt at åbne ægget at få adgang til embryo og udføre forskellige micromanipulations herunder eksempler som den klassiske vagtel-chick kimære system til at studere celle skæbne 2,3, injektion af retrovirus til overekspression i specifikke væv under udviklingen 4,5 og eksplantation kultur at identificere udviklingsmæssige signalsystemer kilder 6. For nylig Kimærer frembringes mellem umærkede værter med transplantater fra en transgen kylling, der udtrykker GFP har vist, at kombinationen af klassisk podning og genmodificering kan give vigtig indsigt i udviklingen 7,8.
Den lethed, hvormed den fugleembryo kan manipuleres har gjort det en fremragende model til undersøgelse af lemmerudvikling 9. Anvendelse af specifikke vækstfaktorer til udviklingslandene lemmer in vivo har været medvirkende til at identificere faktorer, der ændrer lemmer mønsterdannelse 10,11 og fortsætter med at give indsigt i denne proces 12. Denne fremgangsmåde er også blevet anvendt til at undersøge de faktorer, der regulerer muskeludvikling og har afdækket roller for mange signaler, såsom Wnts 13, BMP'er 14 og HGF 15.
For nylig denne teknik er blevet anvendt til at undersøge de signaler, der styrer myogene genekspression i knopskydninger og har vist, at interaktioner mellem FGF18 og retinsyre kan styre tidspunktet for MyoD ekspression 16. Ved hjælp af en kombination af vækstfaktorer og små molekyler, der kan indlæses på perler og derefter podet direkte ind i specifikke væv på definerede udviklingsstadier giver mulighed for at gribe ind på næsten hvilket som helst tidspunkt og region under udvikling. Dette er blevet anvendt til INVEstigate mange processer, herunder somite mønsterdannelse 17,18, neurale specifikation 19, neuralkam migration 20 og aksen forlængelse 21.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til podning perler gennemvædet i enten vækstfaktorer eller inhibitorer i at udvikle kylling lemmer. Det har været anvendt til at bestemme virkningerne af disse signaler på myogenese ved at analysere muskel specifik genekspression med in situ hybridisering. Vi beskriver transplantater enten via heparin gennemblødt perler, der anvendes til vækstfaktorer, eller AG 1-X2 perler til små hydrofobe molekyler, såsom retinsyre eller småmolekylære inhibitorer af specifikke signalveje. Men andre perler er også tilgængelige som er blevet anvendt til at levere både FGF'er 22 og Shh 23.
Brugen af perle transplantater anvendes direkte til at udvikle væv in ovo er et kraftfuldt værktøj til at dissekere rolle vækstfaktor signalering under udviklingen giver uovertruffen kontrol over udviklingsstadiet, hvor de anvendes, og varigheden af eksponeringen.
Valget af perle for hver type molekyle er vigtig. Små hydrofobe molekyler, såsom de her beskrevne inhibitorer og retinsyre, normalt binder godt til derivatiseret AG 1-X2 perler selv om det er nødvendigt at teste …
The authors have nothing to disclose.
This work was partly funded by a University of Nottingham Early Career award to DS. RM is funded by the Higher Committee for Education Development of Iraq.
Heparin acrylic beads | Sigma | H5263 | The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads, |
AG 1-X2 beads | Bio-Rad | 140-1231 | |
Affi Gel blue beads | Bio-Rad | 153-7301; 153-7302 | These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads |
FGF18 | Peprotech | 100-28 | Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose. |
U0126 | Cell Signalling | 9903 | Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
BMS-493 | Tocris Biosciences | 3509 | Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light. |
Black Indian ink | Windsor and Newton | 5012572003384 (30ml) | While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos |
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95% | Alfa Aesar | 10404 | |
Penicillin / streptomycin | Sigma | P0781 | Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS |