Negl Perler inn Utvikling kyllingembryo Limbs å identifisere signaltransduksjonsveier Påvirker Gene Expression

Summary

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

Abstract

Ved hjelp av kyllingembryoer er det mulig å teste direkte effektene av enten vekstfaktorer eller spesifikke inhibitorer av signalveier på genekspresjon og aktivering av signaloverføringsreaksjonsveier. Denne teknikken gjør at levering av signalmolekyler på presist definerte utviklingsstadier for bestemte tider. Etter dette embryo kan høstes og genekspresjon undersøkes, for eksempel ved in situ hybridisering, eller aktivering av signaltransduksjonsveiene observert med immunfarging.

I videoen heparin perler dynket i FGF18 eller AG 1-X2 perler dynket i U0126, en MEK inhibitor, er podet inn i lem knopp i ovo. Dette viser at FGF18 induserer uttrykk for myod og ERK-fosforylering og både endogene og FGF18 indusert myod uttrykk hemmes av U0126. Perler dynket i en retinsyre antagonist kan potensere tidlig myod induksjon av FGF18.

Denne tilnærmingen kan være ossed med et bredt spekter av forskjellige vekstfaktorer og inhibitorer og kan lett tilpasses andre vev i utvikling av embryo.

Introduction

Avian embryo har gitt et kraftig verktøy for å studere utvikling i mange år ^1. En av de mest nyttige egenskaper er at de er forholdsvis lette å manipulere. Ekstern utvikling gjør det mulig å åpne egget å få tilgang til embryoet og utføre forskjellige micromanipulations inkludert eksempler som klassiske vaktel-chick kimær system for å studere celle skjebne ^2,3, injeksjon av retrovirus for overekspresjon i bestemte vev under utvikling ^4,5 og eksplantering kultur for å identifisere utviklingssignalkilder ^6. Flere nylig kimeras generert mellom umerkede vertene med grafts fra en transgen kylling linje som uttrykker GFP har vist at kombinasjonen av klassisk pode og genmodifisering kan gi viktig innsikt i utviklingen ^7,8.

Den enkle som avian embryo kan manipuleres har gjort det en utmerket modell for å studere lemutvikling ^9. Bruk av spesifikke vekstfaktorer for å utvikle lemmer in vivo har vært medvirkende i å identifisere faktorer som endrer lem mønster ^10,11 og fortsetter å gi innsikt i denne prosessen ^12. Denne fremgangsmåten har også blitt brukt til å studere de faktorer som regulerer muskelutvikling og har avdekket roller for en rekke signaler som Wnts ^13, BMP ¹⁴ og ¹⁵ HGF.

Nylig denne teknikken har blitt brukt til å undersøke de signalene som styrer myogenic genuttrykk i lem knopp og har vist at interaksjoner mellom FGF18 og retinsyre kan kontrollere tidspunktet for myod uttrykk ^16. Ved hjelp av en kombinasjon av vekstfaktorer og små molekyler som kan legges på perler og deretter podet direkte inn i bestemte vev på definerte utviklingsstadier gir mulighet til å gripe inn på nesten enhver tid og region under utvikling. Dette har blitt brukt til å investigate mange prosesser inkludert somitt mønster ^17,18, nevrale spesifikasjon ^19, neural crest migrasjon ^{20 og} aksen forlengelse ^21.

Her beskriver vi en metode for pode perler dynket i enten vekstfaktorer eller hemmere til å utvikle kylling lemmer. Dette har blitt benyttet for å bestemme effekten av disse signaler på myogenese ved å analysere muskel spesifikk genekspresjon med in situ-hybridisering. Vi beskriver grafts ved å bruke enten heparin fuktet perler, som brukes for vekstfaktorer, eller AG 1-X2-perler for små hydrofobe molekyler, slik som retinsyre eller lavmolekylære inhibitorer av spesifikke signalveier. Men andre perler er også tilgjengelige som har blitt brukt til å levere både FGF ²² og Shh ^23.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle disse eksperimentene følger dyr omsorg og etiske retningslinjer ved Universitetet i Nottingham. 1. Utarbeidelse av Heparin Perler for Negl Vask heparin perler grundig i PBS før bruk. Merk: Perler kan lagres ved 4 ° C som en oppslemming i PBS. Velg perler for pode ved å fjerne dem fra lager med en 20 mL pipette inn i en 1 ml dråpe PBS. Deretter bruker en mikropipette satt til 2 mL å overføre perlene inn i en 20 ul dråpe av PBS…

Representative Results

På HH trinn 21 myod ikke uttrykkes i å utvikle lem myoblaster selv om farging kan sees i myotome av utviklings somites (figur 1A). Figur 1B viser in situ hybridisering for myod 6 timer etter en FGF18 vulst transplantat. Myod blir indusert i myoblaster nær vulsten mens det er ingen ekspresjon i det kontralaterale lem. Ko-poding av en vulst fuktet i U0126, en spesifikk inhibitor av MEK, blokker FGF18 induksjon av myod (figur 1C). Tilsvar pode en U0126 perle ve…

Discussion

Bruken av perle grafts brukes direkte til å utvikle vev i ovo er et kraftig verktøy for å dissekere rollen som vekstfaktor signale under utvikling som gir enestående kontroll over utviklingsstadiet hvor de brukes og varigheten av eksponeringen.

Valget av vulsten for hver type molekyl er viktig. Små hydrofobe molekyler, slik som de inhibitorene som beskrives her og retinsyre, vanligvis bindes godt til derivatisert AG 1-X2-perler, selv om det er nødvendig å teste effektiviteten av hver …

Materials

Heparin acrylic beads	Sigma	H5263	The acrylic-heparin beads used have been discontinued. However a replacement product is available, Heparin agarose beads, cat no H6508. These are transparent so harder to work with but can be stained with phenol red in the same way as AG 1-X2 beads,
AG 1-X2 beads	Bio-Rad	140-1231
Affi Gel blue beads	Bio-Rad	153-7301; 153-7302	These beads have been used with a range of growth factors including Shh and FGFs and can be used to replace heparin beads
FGF18	Peprotech	100-28	Resuspend in PBS with 0/1% BSA, prepare single use aliquots of 0.5-1ul and store at -80°C. Batches and suppliers can vary so different concentrations should be tested to determine an effective dose.
U0126	Cell Signalling	9903	Make to 20mM stock in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
BMS-493	Tocris Biosciences	3509	Resuspend in DMSO and store in single use aliquots at -80°C. Protect from light.
Black Indian ink	Windsor and Newton	5012572003384 (30ml)	While alternatives to this product are available care should be taken as some inks are toxic to embryos
Tungsten wire, 0.1mm dia. 99.95%	Alfa Aesar	10404
Penicillin / streptomycin	Sigma	P0781	Dilute 100X in PBS/ink and PBS/FCS