This protocol describes the steps and data analysis required to successfully perform optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI). ofMRI is a novel technique that combines high-field fMRI readout with optogenetic stimulation, allowing for cell type-specific mapping of functional neural circuits and their dynamics across the whole living brain.
The investigation of the functional connectivity of precise neural circuits across the entire intact brain can be achieved through optogenetic functional magnetic resonance imaging (ofMRI), which is a novel technique that combines the relatively high spatial resolution of high-field fMRI with the precision of optogenetic stimulation. Fiber optics that enable delivery of specific wavelengths of light deep into the brain in vivo are implanted into regions of interest in order to specifically stimulate targeted cell types that have been genetically induced to express light-sensitive trans-membrane conductance channels, called opsins. fMRI is used to provide a non-invasive method of determining the brain’s global dynamic response to optogenetic stimulation of specific neural circuits through measurement of the blood-oxygen-level-dependent (BOLD) signal, which provides an indirect measurement of neuronal activity. This protocol describes the construction of fiber optic implants, the implantation surgeries, the imaging with photostimulation and the data analysis required to successfully perform ofMRI. In summary, the precise stimulation and whole-brain monitoring ability of ofMRI are crucial factors in making ofMRI a powerful tool for the study of the connectomics of the brain in both healthy and diseased states.
Оптогенетика функциональная магнитно – резонансная томография (ofMRI) представляет собой метод романа , который сочетает пространственное разрешение высокого поля фМРТ с точностью оптогенетика стимуляции 1-11,38, что позволяет клеточный типоспецифической отображение функциональных нейронных цепей и их динамику по всей головной мозг. Оптогенетика позволяет специфические типы клеток, которые будут направлены на стимулирование путем введения светочувствительных трансмембранной проводимости каналов, называемых опсинов. Конкретные элементы нейронных цепей являются генетически модифицированными , чтобы выразить эти каналы, что позволяет миллисекунду-временной шкалы модуляции активности в интактном мозге 1-15. ФМРТ обеспечивает неинвазивный метод определения глобальной динамической реакции мозга на оптогенетика стимуляции специфических нейронных цепей путем измерения крови кислородом зависимой от уровня (полужирный) сигнала 16-18, который обеспечивает косвенное измерение активности нейронов.
Сочетание этих двух методов, называемых оптогенетика функциональной магнитно-резонансной томографии (ofMRI), является преимуществом по сравнению с другими методами записи активности мозга во время стимуляции, таких как электрофизиологии, потому что он может обеспечить представление всей мозга при относительно высоким пространственным разрешением. Это позволяет обнаруживать активности нейронов в ответ на целевой стимуляции на больших расстояниях от места стимуляции без необходимости имплантации инвазивных регистрирующих электродов 1-11. ofMRI имеет преимущество по сравнению с более традиционным способом выполнения электрической стимуляции во время фМРТ, которые могут рекрутировать различные типы клеток вблизи электрода и тем самым посрамить причинное влияние каждого населения 19. Кроме того, электроды , используемые для электрической стимуляции и генерируемый ток может производить артефакты во время МР – томографии 20. Действительно, ofMRI позволяет наблюдать влияние на глобальной активности мозга от конкретного modulatiна из самых разнообразных типов клеток за счет использования современных методов генетической нацеливания, таких как система Cre-LOX у трансгенных животных или использование промоторов. Комбинаторные оптический контроль с мониторингом всего головного мозга возможно с ofMRI путем использования обоих NpHR ингибировать и ChR2 возбуждать специфические типы клеток. Оптогенетика инструментарий доступен для использования в ofMRI также быстро улучшается с течением времени с введением опсинов с повышенной светочувствительности или улучшенной кинетики, стабилизированных ступенчатой функции опсинов (SSFOs) или красным смещением опсинов, что может свести на нет потребность в имплантированным волокна оптика, что позволяет неинвазивной стимуляции во время съемки 21. Эти возможности недоступны при использовании электрической стимуляции.
Тем не менее, сигнальные артефакты , возникающие в результате нагревания ткани вследствие легкой доставки в головном мозге было зарегистрировано 22, где температура индуцированное изменение времен релаксации было показано , чтобы произвести pseuсделать активацию. Поэтому исследователи, осуществляющие ofMRI должны знать об этой потенциальной запутать. При правильной настройке и управления, проблема может быть решена. Кроме того, относительно низкое временное разрешение измерения отклика гемодинамические в фМРТ может быть ограничивающим фактором для некоторых применений этой техники.
Этот протокол первый описывает строительство волоконно – оптических имплантатов , которые позволяют доставку определенных длин волн света глубоко в мозг в естественных условиях. Затем протокол описывает доставку опсина-кодирующий вирусный вектор для точной области мозга с помощью стереотаксической хирургии. Следующий протокол описывает процесс целого мозга функциональной МРТ при одновременной световой стимуляции. И, наконец, протокол описывает базовый анализ данных полученных данных.
Следует отметить, что описанный здесь оптогенетика требуют хронического имплантат для легкой доставки. Тем не менее, волоконно-оптические имплантаты являются стабильными и биосовместимый, что позволяет для продольного сканирования и исследования нейронной схемы в течение периода месяцев 23,24.
Таким образом, точное и стимуляция всего головного мозга способность контроля ofMRI являются решающими факторами при принятии ofMRI мощный инструмент для изучения connectomics головного мозга. Кроме того, она может обеспечить новое понимание механизмов неврологических заболеваний , 25 в сочетании с различными моделями животных. Действительно, ofMRI был использован для выяснения сетевой активности различных гиппокампа субрегионов , связанных с приступами 8. Поэтому, лаборатории, заинтересованные в ответах на вопросы неврологии системного уровня найдут эту технику значение.
Движение предмета во время формирования изображения является существенным источником артефакт, который может привести к повреждению данных. Надлежащим обеспечение животное на люльке визуализации может свести к минимуму такие артефакты, как будет поддерживать соответствующие уровни анестезии. Здесь мы использовали изофлуран но альтернативные анестетики, такие как медетомидина или кетамином и ксилазином, также следует учитывать. Тем не менее, уровни и выбор анестетика может влиять на многие параметры в головном мозге, в том числе Смелый ответ 28. Isoflurane может вызвать изменения в возбудимости нейронов 29. Другие анестетики могут также влиять на ГАМК синаптическую ингибирование 30. Таким образом, выбор анестезии важно при выполнении ofMRI учитывая его способность влиять на нейронную активность. ofMRI в отсутствие анестезии возможно, но может быть сложной задачей с увеличением движения от животного, которое может быть уменьшено, если животное приученный; такие просыпаются исследования ofMRI ранее выполнилий позволит избежать эффекта сбивающий анестезии на мозг 9,10. Алгоритмы коррекции движения постобработка может быть использован для значительного уменьшения эффектов движения. Некоторые из этих методов, существуют, в том числе обратной Гаусса-Ньютона алгоритма, используемого в данном протоколе, который сводит к минимуму сумму квадратов функции стоимости опорного изображения, и изображение, при коррекции. Алгоритм полезен , поскольку он позволяет быстро и надежную коррекцию движения, с использованием графического дизайна параллельной платформы для сокращения времени обработки 27.
Для восстановления данных в этом протоколе, пользовательские написано программное обеспечение в среде MATLAB была использована для двумерной гридинга реконструкции, где образцы спиральных реконструируются в к-пространстве в привязке к сетке изображений 31-33. Данные временных рядов были получены путем расчета процента модуляции BOLD сигнала каждого воксела относительно базового периода, собранные до стимуляции. Воксели которого временные ряды синchronized к блокам оптогенетика стимуляции со значением когерентности 0,35 или выше, были определены как активированных вокселей; это значение когерентности соответствует менее чем 10 -9 значения P 8. Значения Согласованность рассчитывались как величина преобразования Фурье на частоте повторных циклов стимуляции , разделенное на квадраты суммы чисел всех частотных составляющих 8,27. Ошибка Familywise можно управлять с помощью коррекции Бонферрони для множественных сравнений. могут быть использованы альтернативные методы анализа, включая параметрические статистические тесты, такие как общие линейные модели (GLMS). Метод когерентности требует меньше предварительных знаний о HRF по сравнению с обычной общей линейной модели. Таким образом, предпочтительно, при изучении данных с использованием ofMRI. Тем не менее, метод когерентности может быть использован только для данных с блок-схем или выбранных конструкций событий, связанных с фиксированным интервалом межстимульный и не могут быть использованы в данных ofMRI с другими ивент-отношеTed конструкции или смешанные конструкции. Впоследствии, динамическое моделирование причинной (DCM) может быть использована для анализа взаимодействий между областями мозга, выявленных в ходе ofMRI. DCM является байесовский статистический метод , разработанный для анализа функциональной связности из системы ответов на экспериментальных входов во время фМРТ 34.
Дополнительные технические проблемы для ofMRI обсуждаются здесь. Имплантаты могут быть повреждены или упасть, что приводит к удалению пораженного животного из исследования. Re-имплантацией операции не рекомендуется из-за дополнительной неопределенности ориентации тот же ROI, как и в оригинальной имплантации хирургии и из-за проблем защиты животных. Из-за значительного количества времени и ресурсов, вложенных в каждый предмет животных, рассмотрение прочности материала является важным фактором при выборе подходящего стоматологического цемента для использования в исследованиях ofMRI. Операция имплантации является решающим фактором в максимизации долговечности implanт и при условии животных. Например, обеспечение того, чтобы череп сухим перед нанесением стоматологического цемента и размещение достаточного количества цемента вокруг керамического наконечника имплантата может обеспечить стабильность в течение потенциального многомесячную сроки животного во время исследования. Кроме того, альтернативные конструкции клетки могут быть изучены и обсуждены с местным средства по уходу за животными, чтобы избежать клетки с проволочными верхушек держащих пищи и воды, которые часто выступают в клетку и обеспечить возможности для животного повредить имплантат. Важно отметить, что стоматологический цемент должен быть выбраны тщательно, чтобы уменьшить артефакты, которые влияют на отображение и альтернативные цементы могут быть протестированы с помощью нанесения на фантоме и получения изображений в сканер перед использованием в экспериментах на животных. Метод проб и ошибок с различными зубных цементов показал, что цемент, используемый в данном протоколе дает относительно небольшое число артефактов. Еще одна техническая проблема при выполнении ofMRI является точность размещения волоконно-оптических в планируемом ROI, учитывая ОтбораEmely малые расстояния , которые могут существовать между ядрами в мозге 35. После завершения имплантации хирургических операций, Т2-взвешенных анатомических сканирование может быть использовано для определения правильного размещения, накладывая на Атласа мозга. Мастерство хирурга и практики, выполняющего эти операции могут улучшить правильные цены размещения. Специфичность и экспрессия опсином на намеченное ROI может быть проверена при завершении исследования путем перфузии животного и фиксации мозг, с помощью иммуногистохимии или эндогенное флуоресценции репортерного белка, привязанную к опсином для визуализации. Эти репортерные белки также могут быть локализуется с другими белками , чтобы гарантировать , что опсина выражается в желаемых нейронных типов клеток 1,8,15,25. Как упоминалось ранее, артефакты могут возникнуть при выполнении ofMRI из – за нагревания ткани из легкого доставки 22. Нагрева ткани вызывает изменение времен релаксации, что приводит к ложным BOLD сигнала. Чтобы гарантировать, что асактиваций в результате световой стимуляции во время ofMRI не из-за этого артефакта, Opsin-отрицательный контроль должен быть выполнен, в которых либо физиологический раствор вводили животным или животным, которым вводили контроль флуорофором векторами (например, AAV-CaMKIIa-EYFP) подвергаются ofMRI. Кроме того, только хорошо построены волоконно-оптические имплантаты с хорошей светоотдачей передачи следует использовать для удаления необходимость использования высоких мощности лазера. Исследования ofMRI были выполнены в каком ложной активации из – за нагрева ткани не было проблемой 1,6-8,10,11.
Что касается выбора вектора для введения необходимых оптогенетика генов в нейроны для экспрессии, AAVs не известно, вызывают заболевания у людей и, следовательно, представляют собой удобный вариант, учитывая более низкую уровня биологической безопасности, необходимые для использования этих агентов (BSL-1). Кроме того, множество векторных ядер несут AAVs упакованные с различными оптогенетика генов в наличии и с множественными серотипов. Серотип AAV должны быть выбраны бAsed на намеченной цели клеточной популяции , чтобы обеспечить оптимальные уровни экспрессии 36,37. Лентивирусов также могут быть использованы, но требуют более высокого уровня биологической безопасности. Период времени, необходимый для достаточного экспрессии генов оптогенетика варьирует в зависимости от конкретной модели животного, используемого на конкретном AAV, используемой и на конкретной экспериментальной парадигмы. В этом протоколе, Спрэг Dawley крыс на 11 недель используются и оптогенетика исследования начинаются от четырех до шести недель после инъекции вируса. Трансгенные мыши, также могут быть использованы в оптогенетика исследованиях. Необходимо проводить пилотные эксперименты с целью определения конкретного количества времени, необходимого для достаточного экспрессии опсинов. Стимулирующие парадигм может изменяться в зависимости от конкретного используемого опсином. В этом протоколе, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP используется и парадигма стимуляции 20 сек вкл / выкл 40 сек. При использовании SSFO, парадигма стимуляции будет меняться, потому что SSFO требует лишь краткий импульс света, чтобы быть переменного токаа затем, усиленное акцией короткий импульс света на другую длину волны, чтобы быть прекращено.
Дополнительным критическим фактором при выполнении ofMRI является предотвращение утечки света от интерфейса имплантата ободка с помощью кабеля волоконно-оптический патч во время оптогенетика стимуляции, чтобы предотвратить Поразительным сигнал мозга, исходящий от визуальной стимуляции, даже когда наркозом животное. Конусы черной изоленты можно использовать, чтобы блокировать свет от манжет и покрыть глаза животного. Важно отметить, что физиологические значения , включая выдохе СО 2 и температуру тела субъекта должны быть надлежащим образом в течение всего периода формирования изображения. Выдыхаемого СО 2 должен составлять от 3 - 4% и температуру тела при 37 ° С. Кроме того, Шиммирование последовательности, чтобы уменьшить, насколько это возможно, как неоднородность в магнитном поле перед началом ofMRI значительно сканирует определяет качество получаемых BOLD данных. Контроль этих факторовимеет решающее значение для получения достоверных данных ofMRI. В этом протоколе, DPSS лазеры используются в качестве источника света для оптогенетика стимуляции. Поскольку лазерный свет является когерентным, более чем достаточно мощности может быть легко подается через волоконно-оптические. Светодиодные источники света в сочетании с волоконной оптикой доступны от коммерческих поставщиков, но имеют тот недостаток, уменьшенной мощности передачи света. Источник лазерного луча требует выравнивания для каждого конкретного соединительного кабеля волоконно-оптического, но с практикой, выравнивание может быть достигнуто в течение нескольких секунд до нескольких минут.
Будущие приложения ofMRI включают в себя использование опсинов следующего поколения, таких как красным смещением опсинов чтобы позволить неинвазивной стимуляции во время визуализации. Кроме того, внедрение МРТ-совместимый ЭЭГ или аналогичной записи электродов наряду с оптоволоконным имплантата может позволить для получения данных высоким временным разрешением в дополнение к высоким данным пространственным разрешением МРТ. ofMRI с electrophysiological записи может предоставить обширную информацию о функциональной связности мозга. Таким образом, мощность ofMRI контролировать весь мозг в ответ на стимуляцию специфических клеточных популяций, определяемых генетической или анатомической идентичности делает ofMRI критический инструмент для использования при изучении неврологических заболеваний и из connectomics здорового мозга.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported through funding from the NIH/NIBIB R00 Award (4R00EB008738), Okawa Foundation Research Grant Award, NIH Director’s New Innovator Award (1DP2OD007265), the NSF CAREER Award (1056008), and the Alfred P. Sloan Foundation Research Fellowship. J.H.L. would like to thank Karl Deisseroth for providing the DNA plasmids used for the optogenetic experiments. The authors would also like to thank Andrew Weitz and Mankin Choy for editing the manuscript and all the Lee Lab members for their assistance with the ofMRI experiments.
7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
binocular biological microscope 40X-1000X | Amscope | B100 | |
laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
power meter, Si Sensor, 400-1100 nm | Thor Labs | PM121D | |
Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
NanoFil 100uL syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance , 0.3 mg/mL stock |