Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.
Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.
Karplanter stole på ekstracellulære lag som fungerer som vanntette barrierer mellom plantemateriale og det ytre miljø. Disse lipofile cellevegg-assosierte strukturer begrenser patogene infeksjoner og regulere den passive transport av gasser, vann og oppløste stoffer i og ut av plantevev 1. Slike barrierer er anlegget skjellaget, en synapomorphic struktur unik for planter 2, og ulike suberin holdige diffusjonsbarrierer. Hårstråene er et oleofilt sjikt syntetisert av epidermale celler og bundet til den via en pektinmaterialet lag på den ekstracellulære siden av celleveggen 3-5. Den omgir den primære luft organer av høyere planter, som fungerer som en viktig grensesnitt mellom plantevev og miljø.
Cutin, den strukturelle matrise av skjellaget, og suberin er to uløselige glycerolipid polyestere forbundet med løsemiddeluttrekk voks 2,4. Disse polymer lipids er sammensatt av mettede og umettede fettsyrederivater og er både strukturelt og funksjonelt lignende. Men de er gjenkjennelig med karakteristiske forskjeller i kjemisk sammensetning og deponeringssteder.
Suberin er en alifatisk polyester som ligger inne i celleveggene av enkelte ytre og indre vev som danner en sekundær vegg. Suberized vev inkluderer periderms av røtter, knoller og tree bark, rot endodermis, frø frakk lag og helbredet sår 2. I motsetning cutin inneholder suberin polyester typisk alkoholer, mettede og mono-umettede dikarboksylsyrer, og en stor andel av meget-langkjedede monomerer (C≥20).
Cutin er den mest tallrike lipid polyester i karplanter 6, og er sammensatt av glycerol og C16-C18 interforestrede fettsyrederivater, så som hydroksy og hydroksy-substituerte fettsyrer epoksy-4. Mens sammensetningen av polymerer cutinvarierer mellom tracheophyte arter er de mest dominerende primære monomerer er 10, 16-dihydroksy-16: 0, 18-hydroksy-9,10-epoksy-18: 0, og 9,10,18-trihydroksy 18: 0 fettsyrer. Interessant, Arabidopsis blad og stilk cutin består hovedsakelig av 18: 2 dicarboxylsyre 7,8.
Plante hårstråene presenterer også en betydelig variasjon i tykkelse, som strekker seg fra noen få nanometer til flere mikrometer 9. Siden hårstråene isolasjon er en arbeidskrevende og tidkrevende trinn, særlig for meget tynne blad hårstråene slik som de av Arabidopsis thaliana 8, har fremgangsmåter som omgår hårstråene isolasjon blitt utviklet og validert 7,8. Her beskriver vi en detaljert protokoll for å studere monomersammensetningen av Arabidopsis thaliana cutin i bladene av natriummetoksid (NaOMe) -catalyzed depolymerisering og påfølgende gasskromatografi / massespektrometri (GC / MS) analyse. Denne protokollen gir en robust fremgangsmåte for analysering composition av plante lipid polyestere i hele delipiderte vev, og har blitt tilpasset fra tidligere rapporterte protokoller 7,10,11. Hele vevsprøver er første homogenisert og grundig delipidert, fjerne løsemiddel utvinnbar lipider inkludert cuticular og epicuticular voks, membranlipider, og triacylglyceroler. Cellevegg beriket rester blir så depolymerisert inn beskaffenhet methyl ester monomerer ved natriummetoksyd-katalysert metanolyse. Fettsyremetylestere er trukket ut ved surgjøring, og derivatisert for å oppnå de tilsvarende trimetylsilyl eller acetylderivater. Derivatiserte rester er svært flyktig, og kan bli eluert fra en gass-kromatografi-kolonne på en rimelig temperatur uten å endre deres strukturelle konformasjon under GC / MS-analyse.
I motsetning til andre biopolymerer, slik som DNA og proteiner, er anlegget lipid polyestere som ikke er laget av en mal. I stedet, deres sammensetninger avhenger av spesifisiteten av de enzymer som er tilstede i vev som gjør disse ekstracellulære polymerer. Som sådan, kjemiske analyser av de bærende komponenter er viktig å forstå polyester lipid sammensetning.
Kjemiske metoder for å spalte esterbindinger omfatter forsåpning, hydrogenolyse, syrekatalysert transmethyleringsreaksjoner, og basekatalysert transmethyleringsreaksjoner 2. Hvert av dem har fordeler og ulemper. Forsåpning produserer frie fettsyrer hydroxy syrer som kan gjennomgå sekundære reaksjoner. Hydrogenolyse med litiumaluminiumhydrid (LiAlH4) 16 har blitt brukt for analyse cutin 7. Hydrogenolysen reduserer funksjon karboner til alkoholer og de opprinnelige strukturene må utledes av deuteriolysis med litium aluminium deuteride (LiAlD 4). DeUlempen ved denne tilnærmingen er kravet om høy oppløsning GC / MS for å sammenligne graden av deuteriation av fett polyoler som oppnås for å gi oppdrag av deres strukturer. Syre-katalysert transforestring med metanolisk bortrifluorid (BF 3) er blitt hyppig brukt i cutin og suberin depolymerizations 8,17,18, men reagenset har en begrenset holdbarhet og kan innføre artefakter som skyldes sidereaksjoner 15. Metanolisk svovelsyre gir også metylesterne av monomerene, men med større andeler av 2-hydroksy-fettsyrer, som antagelig ikke er sanne lipid polyesterkomponenter, sammenlignet med andre metoder 10.
Den NaOMe-katalyserte transforestringsmetoden som er beskrevet i denne protokollen produserer fettsyremetylestere som er derivatisert ved silylering av hydroksylgrupper, som gir karakteristiske massespektra for identifikasjon, eller ved acetylering for å gi mer stabile derivater av hydroksylgrupper for kvantifisering. En ulempe med denne teknikken er at hydrolyse konkurrerer med transforestring når vann er til stede i reaksjonen. Vann reagerer med NaOMe (katalysatoren) og produserer NaOH, noe som i sin tur hydrolyserer fettsyremetylestere under dannelse av frie syrer (figur 2D). Dette er en uønsket sidereaksjon fordi to topper vil være til stede for hver fettsyre: en metylester og en TMSI esterderivat, og dermed kompliserer analyse. Ved hjelp av vannfrie reagenser og tilsetning av metylacetat som et ko-oppløsningsmiddel for å konkurrere med forsåpning er således avgjørende skritt for å hindre hydrolyse (figur 2D).
Cutin og suberin inneholde mellom 1 og 26% glyserol fire. Men dette vil monomer ikke bli oppdaget av de eksperimentelle betingelsene beskrevet i denne protokollen. Glycerol er meget hydrofilt, og, i motsetning til de fettsyremetylester monomerer, vil bli eliminert i løpet av de vandige løsningsmiddel-vasketrinn. Denne begrensningen også engjelder særlig rn fr til andre cutin depolymeriseringsprosesser metoder, men glycerol kan bli bestemt i den vandige fase som oppnås etter transforestring ved anvendelse av en enzymatisk metode. Alternativt kan den kvantifiseres ved hjelp av mildere betingelser (f.eks., 0,05 M NaOMe) uten ytterligere vannekstraksjon for å detektere alle monomerer, inkludert glycerol 19,20 .Selv anvendelige for formålet med glycerol kvantifisering, milde betingelser vanligvis gi ufullstendig depolymerisering av cutin og suberin.
Hvis en GC koplet til en flammeioniseringsdetektor (FID) er tilgjengelig, kan alle replikater bli analysert i dette instrument for kvantitative formål, etter at toppene av en representativ prøve er blitt identifisert ved hjelp av GC / MS. Alternativt kan monomerer i GC / FID spor bli identifisert hvis deres oppbevaring indeksene er kjent. Den flammeioniseringsdetektor har spesielt høy følsomhet og et bredt spekter av forholdsmessighet, som er avgjørende for kvantifisering av større og mindre prøvekomponenteri enkle løyper. I tillegg er det robust og lett å vedlikeholde og drive 15.
Den beskrevne protokoll tillater pålitelig og reproduserbar isolering, identifisering og kvantifisering av plante lipid polyester monomerer, slik at den kjemiske karakterisering av mutanter som avviker i blandingen ifølge ett eller flere lipid-polyester monomerer. Prosedyren er skalerbar, det kan enkelt tilpasses til å behandle både små og bulk mengder av ulike plantematerialer, inkludert røtter, frø, blader, stengler og blomster. Massespektraldata av lipid polyester monomerer fra mange arter har blitt publisert f.eks., 21-26 og utgjør verdifulle ressurser for å identifisere ukjente monomerer når tilpasse denne protokollen til andre vev og / eller arter. Denne metoden gjelder for undersøkelser av biosyntese, regulering og distribusjon av lipid polyestere i høyere planter.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research (NSERC)-USRA grant to S.J., and by an NSERC-Discovery Grant to I.M. We thank Richard Bourgault, Meghan Rains, and Amanda Fluke for technical assistance. Seeds of att1-1 and att1-2 mutants were kindly provided by Dr. Jian-Min Zhou, Institute of Genetics and Developmental Biology, Beijing, China.
Chemicals | |||
2-propanol | Fisher Scientific | BPA451-4 | Solvent for delipidation |
Anhydrous sodium sulfate | Fisher Scientific | S421500 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102 | Derivatization agent |
BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide) | Sigma-Aldrich | 15222 | Derivatization agent |
Butylated hydroxytoluene (BHT) | Sigma-Aldrich | 101162 | Antioxidant |
Calcium chloride, anhydrous | Fisher Scientific | C614-3 | Desiccation agent |
Calcium suflate, anhydrous (DRIERITE- 8 MESH with indicator) | Acros Organics | 219090020 | Desiccation agent |
Chloroform (Trichloromethane) | Fisher Scientific | C6074 | Organic solvent |
Glacial acetic acid | Fisher Scientific | BP2401212 | Acidification agent |
Helium carrier gas, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1046 | Carrier gas, GC/MS |
Heptane | Fisher Scientific | H3501 | Organic solvent |
Hexanes | Fisher Scientific | H3024 | Organic solvent |
Methanol | Fisher Scientific | A4124 | Organic solvent, transmethylation reactive |
Methyl acetate | Sigma-Aldrich | 296996 | Organic solvent |
Methyl heptadecanoate | Sigma-Aldrich | H4515 | Internal standard (1mg/mL stock) |
Methylene dichloride (Dichloromethane) | Fisher Scientific | D374 | Organic solvent |
Nitrogen, compressed | Air Liquide | ALPHAGAZ1-UN1044 | Carrier gas, GC-FID |
Pentadecanolactone | Fluka | 76530 | Internal standard (1 mg/mL stock) |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | Co-solvent for derivatization |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358212 | Saline solution |
Sodium methoxide (25wt.%) | Sigma-Aldrich | 156256 | Nucleophile |
Toluene | FIsher Scientific | T2904 | Organic solvent |
Plant Growth Supplies | |||
Pro-Mix PGX | Premier Tech Horticulture Ltd | Pro-Mix PGX is recommended to grow Arabidopsis plants (Eddy, R. and Hahn, D.T., 2012,http://docs.lib.purdue.edu/pmag/2) Purdue Methods for Arabidopsis Growth. |
|
PermaNest Humidity Dome | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | GD2211-24 | |
Perma-Nest Plant Trays (22x11in) | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | N/A | |
Square greenhouse pots, 3.5 inch | Grower's Solution, LLC, Cookeville, TN | P86 | |
General Purpose Plant Fertilizer, Plant-Prod 20-20-20 | Premier Tech Home and Garden In., Brantford, ON | N/A | |
Glassware | |||
13 x 100 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-13100 | |
16 x 125 mm glass test tube with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-16125 | |
20 x 125 mm glass test tubes with Teflon-faced screw cap | Kimble Chase Life Science and Research Products LLC | 45066A-20125 | |
GC vial caps | National Scientific | C400051A | |
GC vial microinserts | National Scientific | C4011631 | |
GC vials | National Scientific | C40001 | |
Disposable pasteur pipets | Fisher Scientific | 1367820B | |
Flasks | Fisher Scientific | ||
Equipment | |||
Allegra X15R centrifuge | Beckman Coulter | ||
Analytic balance | Fisher Scientific | ||
Belly dancer | A shaker can be used for this purpose if Belly Dancer not available | ||
DB-5 Capillary GC column | J&W Scientific, CA, USA; | 30 m x 0.25 mm x 0.25 μm film thickness | |
Desiccator | |||
Isotemp 202 water bath | Fisher Scientific | ||
ISQ LT single quadupole mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Heat block | Fisher Scientific | ||
Nitrogen evaporator | |||
Polytron homogenizer | Birkmann | ||
Trace 1300 gas chromatograph | Thermo Scientific | ||
Two-stage regulator | Air Liquide | Q1-318B-580 | |
Vacuum desiccator | Fisher Scientific | ||
Vortex mixer | Fisher Scientific |