Высокое разрешение Количественное запаха, руководствуясь поведения в<em> Дрозофилы</em> Использование<em> Flywalk</em> Парадигма
Summary
Автоматизированная система отслеживания Flywalk используется для высокого разрешения количественного запаха руководствоваться поведения в дрозофилы.
Abstract
В их естественной среде, насекомые, такие как уксус летать дрозофилы были засыпаны огромным количеством химически различных пахучих веществ. Чтобы усложнить ситуацию еще дальше, запахи, обнаруженные нервной системе насекомых, как правило, не одиночные соединения, но смеси, состав и коэффициенты концентрации меняться. Это приводит к почти бесконечное количество различных стимулов обонятельные, которые должны быть оценены нервной системы.
Чтобы понять, какие аспекты запах стимул определить свою оценку по лету, поэтому желательно, чтобы эффективно изучить запах наведением поведение по отношению к многим пахучих веществ и запахов смесей. Для непосредственно коррелируют поведение на нейронной активности, поведение должно быть количественно в сопоставимой времени и в одинаковых условиях стимулирования, как и в нейрофизиологических экспериментах. Тем не менее, многие используемые в настоящее время обонятельные биопробы в Drosophila neuroethology довольно специальванный либо в сторону эффективности или к резолюции.
Flywalk, автоматизированная доставка запах и система слежения, устраняет разрыв между эффективностью и разрешения. Это позволяет определить, когда именно запах пакет стимулировал свободно ходить муху, и определить динамическое animal's реакцию поведения.
Introduction
Главная цель любого neuroethological исследования, чтобы установить причинно-следственную связь между активностью состояний отдельных нейронов или нервных цепей и поведения организма. Для достижения этой цели нейронную активность и поведение должны быть проверены в одинаковых условиях стимулирования и эти условия стимулирования в идеале должны быть аналогичны тем, нервная система под пристальным превратилась в смысл. Особенно, когда дело доходит до поведенческих биопроб, эти требования исторически оказались весьма требовательны в дрозофилы обонятельный neuroethology.
После освобождения от источника, запах перья быстро распадаются на тонких нитях с турбулентной диффузии, вызванной движение воздуха является основным фактором, определяющим распределение запах 1. В результате насекомое навигацию к источнику запаха испытывает периодическую стимуляцию с запахом пакетов перемежаются с переменными интервалами чистым воздухом. И то и другоеходьба и летающих насекомых – в том числе у дрозофилы – были продемонстрированы использовать эту прерывистый режим стимуляции для навигации по растущие с наветренной стороны от факела встречи и преимущественно движется боковой ветер в отсутствие запахов 2 – 5. В то время как процедуры стимуляции физиологических экспериментов в значительной степени сходны насекомое может испытать в своей природной среде либо для обеспечения единого клубами запахов, вкрапленных длительных периодов чистого воздуха или динамических последовательностей стимуляции 6 – 11, многие поведенческие биопроб, используемых в Drosophila neuroethology, таких как ловушки анализа , открытое поле арены или Т-лабиринт полагаться на запах градиентов 12 – 15. Тем не менее, из-за запаха градиенты по определению являются переменными в концентрации в зависимости от расстояния от источника запаха, конкретное поведение не может быть отнесена к точной концентрации запаха, используя эти парадигмы. Кроме того, наклонзапах градиент критически зависит от физико-химических свойств одоранта. Градиент очень летучего соединения будет мельче, чем созданная менее летучего соединения и, следовательно, труднее отслеживать для организма, опираясь на измерения разности концентрации в пространстве в качестве единственного средства навигации 16 – 20, которые могут привести к неправильному толкованию обонятельных предпочтений в частности в выборе анализов. Этот эффект также весьма вредно при расследовании поведение по отношению к запах смеси, потому что это приводит к различным соотношением компонентов смеси в каждой точке в пространстве и, следовательно, снова исключает четкую корреляцию между физиологией и поведением.
В то время как уксус мух, как правило, объединять в брожения фруктов, они одиночные в их навигации к источникам питания и яйцекладки сайтов. Тем не менее, вместо того, тестирование отдельных животных многих поведенческих парадигмы используется в Drosophila neuroetholoгы изучить запах наведением поведение когорт мух и привлекательность оценивается как доля мух, выбирающих аромат по контрольной стимула. Эти когорты эксперименты внесли большой вклад в понимание летучей neuroethology и многие из наблюдений, сделанных с их помощью может быть подтвержден в одной мухи экспериментов. Тем не менее, было отмечено, что летит могут влиять друг на other's решение 21, а в крайних случаях оценка запаха может перейти от безразличия к расторжению в зависимости от плотности населения 22. Кроме того, результаты этих видов экспериментов часто предоставляют только конечную последовательность поведенческих решений, а не наблюдая, что муха делает в то время как это делает, что бы желательно при попытке соотнести поведение с нейронной активности. Эти когорты эксперименты довольно низким разрешением контрастируют с высоким разрешением методов одного мух, таких, как привязанные арен летных и беговыми дорожками, которые позволяютдля прямого наблюдения поведенческих реакций во время стимул представлен 20,23,24. Тем не менее, эксперименты когорты по-прежнему популярны, потому что они очень эффективны и обеспечивают надежные результаты даже при сравнительно низкой размеров образца, потому что межиндивидуальную и между проб изменчивости частично в среднем из-за наблюдения за популяциями длительных периодов времени. В то время как на привязи полета и беговая дорожка, вероятно, предоставить золотой стандарт в отношении стимулов презентации и временное разрешение, арены, используемые предназначены для одиночных животных, и поэтому много времени, чтобы получить размеры образца необходимо для статистического анализа. Несколько иные подходы недавно были разработаны, которые позволяют эффективное приобретение поведенческих данных высокого разрешения в сочетании с четкой режима стимула. Они включают в себя без присмотра 3D-слежение нескольких мух уксуса в аэродинамической трубе в сочетании с точной 3D-модели запах шлейфа 5 </SUP>, отслеживание нескольких отдельных мух в выборе камер, поставляемых с воздушных потоков с обеих сторон 25 и парадигмы Flywalk 26.
В Flywalk, 15 отдельных мухи расположены в небольших стеклянных трубок и постоянно контролируется с помощью накладных камеры под красных фонарей условиях. Запахи добавляются к непрерывному воздушного потока 20 см / сек, и проходить через стеклянных трубок с постоянной скоростью. Воздушный поток увлажняется, пропуская его через 250 мл флаконах, содержащих по дистиллированную воду (увлажнителей) перед входом в систему доставки запаха. В flies' позиции отражаются в квадратной области интереса (ROI), охватывающей большую часть длины труб запах (но не включая внешние края труб (примерно 5 мм с каждой стороны), где мухи не может двигаться дальше вверх или ветру) вокруг времени презентации запаха (фиг.1А, Б). Fly тождества поддерживается постоянным с помощью системы слежения тhroughout эксперимент на основе их Y-позиции (т.е. их пределы стеклянной трубки). Запах стимуляция достигается с помощью многокомпонентного стимул устройство, которое позволяет в презентации до 8 одноместных запахов и всевозможных смесей 26,29 (рис 1B). Курс эксперимента управляется с помощью компьютера, регулирующей систему доставки и сбора запаха температуры и влажности информацию (компьютер 1, рис 1С). Этот компьютер также контролирует регистратора (начала / остановки записи) на втором компьютере, который непрерывно отслеживает лету позиции на 20 кадров в секунду (компьютерные 2). Fly позиции, статус запах клапана (т.е. временной точки открытия клапана), запах ID, температуру и влажность вокруг циклов запах стимуляции вошли на компьютере 2. Таким образом информация о запахом и летать позиции синхронизированы и экспортировать как .csv-файлов, которые могут быть дополнительно обработаны и проанализированы с помощью пользовательских написаны процедуры анализа. Потому каквся система управляется компьютером, без вмешательства человека не требуется во время экспериментальной сессии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя система Flywalk оказывается весьма сложной, на первый взгляд, как только установлен и запущен его легко использовать и производит очень надежные результаты. Чтобы подчеркнуть состоятельность результатов, полученных с биопроб, можно сказать, что представительные результаты, показан?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Даниэль Файт технической помощи и Педро Gouveia на Electricidade Em PO (electricidadeempo.net) для настройки программного обеспечения отслеживания для наших требований. Мы также благодарим Тома Retzke за поддержку во время съемочный процесс. Это исследование было поддержано Общества Макса Планка.
Materials
| Flywalk setup | Custom | details available upon request | |
| stimulus device | Custom | details available upon request | |
| LED cluster | Custom | details available upon request | |
| HD Pro Webcam C920 | Logitech, Lausanne, Switzerland | ||
| 2 Computers | |||
| Flywalk Reloaded v1.0 software | Electricidade Em Pó (electricidadeempo.net) | ||
| Labview 11.0 software | National Instruments, Austin, TX | ||
| Standard fly food | Custom | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Standard fly vials | Greiner bio-one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| aspirator | Custom | ||
| mineral oil | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| odors | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | ||
| 200 µl PCR reaction tubes | Biozym Scientific GmbH, Oldendorf, Germany |
References
- Murlis, J., Elkinton, J. S., Cardé, R. T. Odor plumes and how insects use them. Annu. Rev. Entomol. 37, 505-532 (1992).
- Kennedy, J. S., Marsh, D. Pheromone-regulated anemotaxis in flying moths. Science. 184 (4140), 999-1001 (1974).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Exp. Biol. 209 (15), 3001-3017 (2006).
- Buehlmann, C., Graham, P., Hansson, B. S., Knaden, M. Desert ants locate food by combining high sensitivity to food odors with extensive crosswind runs. Curr. Biol. 24 (9), 960-964 (2014).
- Van Breugel, F., Dickinson, M. H. Plume-tracking behavior of flying Drosophila emerges from a set of distinct sensory-motor reflexes. Curr. Biol. 24 (3), 274-286 (2014).
- Schuckel, J., Meisner, S., Torkkeli, P. H., French, A. S. Dynamic properties of Drosophila olfactory electroantennograms. J. Comp. Physiol. A. 194 (5), 483-489 (2008).
- Geffen, M. N., Broome, B. M., Laurent, G., Meister, M. Neural encoding of rapidly fluctuating odors. Neuron. 61 (4), 570-586 (2009).
- Nagel, K. I., Wilson, R. I. Biophysical mechanisms underlying olfactory receptor neuron dynamics. Nat. Neurosci. 14 (2), 208-216 (2011).
- Martelli, C., Carlson, J. R., Emonet, T. Intensity invariant dynamics and odor-specific latencies in olfactory receptor neuron response. J. Neurosci. 33 (15), 6285-6297 (2013).
- Szyszka, P., Gerkin, R. C., Galizia, C. G., Smith, B. H. High-speed odor transduction and pulse tracking by insect olfactory receptor neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (47), 16925-16930 (2014).
- Nagel, K. I., Hong, E. J., Wilson, R. I. Synaptic and circuit mechanisms promoting broadband transmission of olfactory stimulus dynamics. Nat. Neurosci. 18 (1), 56-65 (2014).
- Larsson, M. C., Domingos, A. I., Jones, W. D., Chiappe, M. E., Amrein, H., Vosshall, L. B. Or83b encodes a broadly expressed odorant receptor essential for Drosophila olfaction. Neuron. 43 (5), 703-714 (2004).
- Knaden, M., Strutz, A., Ahsan, J., Sachse, S., Hansson, B. S. Spatial representation of odorant valence in an insect brain. Cell Rep. 1 (4), 392-399 (2012).
- Zaninovich, O. A., Kim, S. M., Root, C. R., Green, D. S., Ko, K. I., Wang, J. W. A single-fly assay for foraging behavior in Drosophila. J. Vis. Exp. (81), e50801 (2013).
- Farhan, A., Gulati, J., Groβe-Wilde, E., Vogel, H., Hansson, B. S., Knaden, M. The CCHamide 1 receptor modulates sensory perception and olfactory behavior in starved Drosophila. Sci. Rep. 3 (2765), 1-6 (2013).
- Flügge, C. Geruchliche Raumorientierung von Drosophila melanogaster. Z. Vgl. Physiol. 20 (4), 462-500 (1934).
- Borst, A., Heisenberg, M. Osmotropotaxis in Drosophila melanogaster. J. Comp. Physiol. A. 147 (4), 479-484 (1982).
- Louis, M., Huber, T., Benton, R., Sakmar, T. P., Vosshall, L. B. Bilateral olfactory sensory input enhances chemotaxis behavior. Nat. Neurosci. 11 (2), 187-199 (2008).
- Gomez-Marin, A., Stephens, G. J., Louis, M. Active sampling and decision making in Drosophila chemotaxis. Nat. Commun. 2 (441), 1-10 (2011).
- Gaudry, Q., Hong, E. J., Kain, J., de Bivort, B. L., Wilson, R. I. Asymmetric neurotransmitter release enables rapid odour lateralization in Drosophila. Nature. 493 (7432), 42442-42448 (2013).
- Quinn, W. G., Harris, W. A., Benzer, S. Conditioned behavior in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71 (3), 708-712 (1974).
- Ramdya, P., Lichocki, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2014).
- Bhandawat, V., Maimon, G., Dickinson, M. H., Wilson, R. I. Olfactory modulation of flight in Drosophila is sensitive, selective and rapid. J. Exp. Biol. 213 (21), 3625-3635 (2010).
- Duistermars, B. J., Chow, D. M., Frye, M. A. Flies require bilateral sensory input to track odor gradients in flight. Curr. Biol. 19 (15), 1301-1307 (2009).
- Claridge-Chang, A., Roorda, R. D., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Steck, K., Veit, D., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci. Rep. 2 (361), 1-9 (2012).
- Lewis, E. B. A new standard food medium. Drosoph. Inf. Serv. 34, 117-118 (1960).
- Lebestky, T., Chang, J. S. C., et al. Two different forms of arousal in Drosophila are oppositely regulated by the dopamine D1 receptor ortholog DopR via distinct neural circuits. Neuron. 64, 522-536 (2009).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. Compound valence is conserved in binary odor mixtures in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 217 (20), 3645-3655 (2014).
- Olsson, S. B., Kuebler, L. S., et al. A novel multicomponent stimulus device for use in olfactory experiments. J. Neurosci. Meth. 195 (1), 1-9 (2011).
