Los mecanismos moleculares de la descondensación de la cromatina mitótica altamente compactada están mal definidos. Presentamos un ensayo libre de células basado en clústeres de cromatina mitótica aislados de células HeLa y extracto de huevo de Xenopus laevis que reconstituye fielmente el proceso de descondensación in vitro.
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Artículo de método
Una célula de ensayo libre para el Estudio de la cromatina descondensación en la final de la mitosis
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Durante el ciclo celular de los vertebrados, la cromatina experimenta extensos cambios estructurales y funcionales. Al entrar en la mitótica, se condensa masivamente en cromosomas en forma de bastón que son movidos individualmente por el aparato fusiforme mitótico. La condensación mitótica de la cromatina produce cromosomas compactados cincuenta veces más densos que en la interfase. Durante la salida de la mitosis, los cromosomas tienen que restablecer su estado funcional de interfase, que está encerrado por una envoltura nuclear y es competente para la replicación y la transcripción. El proceso de descondensación está morfológicamente bien descrito, pero en términos moleculares es poco conocido: carecemos de conocimiento sobre los eventos moleculares subyacentes y, en gran medida, sobre los factores involucrados, así como sobre su regulación. Describimos aquí un sistema libre de células que recapitula fielmente la descondensación de la cromatina in vitro, basado en grupos mitóticos de cromatina purificados a partir de células HeLa sincronizadas y extracto de huevo de X. laeivis. Nuestro sistema sin células proporciona una herramienta importante para una mayor caracterización molecular de la descondensación de la cromatina y su coordinación con los procesos que ocurren simultáneamente durante la salida mitótica, como la envoltura nuclear y el reensamblaje del complejo de poros.
Introducción
Extracto de huevo Xenopus laevis es una herramienta poderosa y ampliamente aplicada para estudiar eventos celulares complicados en la simplicidad de un ensayo libre de células. Desde su primera descripción por Lohka y Masui 1 se han utilizado ampliamente para estudiar procesos mitóticos tales como la condensación de la cromatina 2, conjunto de husillo 3, la envoltura nuclear desglose 4, sino también el transporte nucleocytoplasmic 5 o 6 replicación del ADN. Los eventos que tienen lugar al final de la mitosis, necesarios para la reforma del núcleo interfásico tales como reforma envoltura nuclea....
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Protocolo
Mitótico cromatina Aislamiento Cluster de células HeLa
1. Preparativos
- Soluciones de cultivo celular
- Preparar medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM) mediante la adición de 10% de suero fetal de ternera, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y glutamina 2 mM a la DMEM. Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 2,7 mM KCl, NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O y 2 mM KH 2 PO 4 en agua desionizada, y ajustar el pH a 7,4 con 10 N de NaOH.
NOTA: PBS se puede mantener como ....
- Preparar medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (DMEM) mediante la adición de 10% de suero fetal de ternera, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y glutamina 2 mM a la DMEM. Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 2,7 mM KCl, NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O y 2 mM KH 2 PO 4 en agua desionizada, y ajustar el pH a 7,4 con 10 N de NaOH.
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Resultados
Dependencia del tiempo de la reacción descondensación
La figura 1 muestra un curso de tiempo típico de ensayo de la descondensación. El grupo de cromosomas visibles al comienzo de la reacción decondenses y se funde en una sola, redondo y el núcleo suave. Cuando el extracto de huevo se sustituye por sacarosa amortiguar el clúster cromosoma sigue siendo condensada, lo que sugiere que la actividad descondensación está presente en el extracto de huevo.
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Discusión
Xenopus laevis extractos de huevo son una herramienta muy útil para reproducir fielmente los procesos celulares in vitro, y este sistema fue utilizado con éxito en la caracterización de ciclo celular y la división celular eventos 2, 3,5,6,17. Debido a las grandes tiendas de componentes nucleares secuestradas en el huevo durante la ovogénesis, extractos de huevo son una excelente fuente de los componentes celulares. En comparación con otros enfoques como RNAi en líneas celulares de.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana para la Investigación y el ERC (AN377 / 3-2 y 309528 CHROMDECON a WA) y un doctorado Comunidad del Boehringer Ingelheim Fonds de AKS Figura 1 y 2 están reimpresos de Developmental Cell 31 (3), Magalska et al., función ATPasas RuvB-como en descondensación de la cromatina en el final de la mitosis, 305-318, 2014, con el permiso de Elsevier.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| tetraclorhidrato de espermina | Fluka analítico | 85610-25G | |
| triclorhidrato de espermidina | Sigma | S2501-5G | |
| digitonina de alta pureza | Millipore | 300410-1GM | |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | |
| timidina | Calbiochem | 6060 | |
| nocodazol | Calbiochem | 487928 | solución tóxica |
| de formaldehído al 37% | Roth | 7398-1 | tóxica |
| de azul de tripano (0,4% ) | Sigma | T8154 | tóxico |
| 1,4-ditiotritol (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF clorhidrato | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatina | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptina | Roth | CN334 | |
| aprotinina | Roth | A162.3 | |
| Percoll (partículas de sílice coloidal solución) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutamina | Gibco | 25030-024 | |
| Penicilina-estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| 75 cm² matraces de cultivo de tejidos | Greiner Bio-one | 658175 | |
| suero fetal bovino inactivado por calor (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Homogeneizador (triturador de tejidos de 40 ml) | Cámara Wheaton | 357546 | |
| Neubauer | Assistent | 441/1 | |
| Tubos de centrífuga Oak Ridge, policarbonato (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µ Filtro de células m, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| citocalasina B | Applichem | A7657,0010 | |
| cicloheximida | Roth | 8682.3 | |
| L-cisteína | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG disponible como Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG disponible como Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (mezcla de calcio-magnesio-sal) | Enzo | ALX-450-002-M010 | |
| agujas de jeringa tóxicas (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatina fosfato sal disódica | Calbiochem | 2380 | |
| creatina fosfoquinasa | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Tubos | ||
| PFA | Sigma | P-6148 | |
| para TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 pulg.) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (puntas con amplia apertura, 1.000 y micro; l) | Biozym | 729065 | |
| solución de glutaraldehído al 50%, grado I | Sigma alderich | G7651-10 ml | de solución tóxica |
| poli-L-lisina al 0,1% (p/v) | Sigma | P8920-100 ml | |
| tubos de fondo plano (6 ml, 16,0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield medio de montaje | Laboratorios vectoriales | H1000 | |
| tubos para TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 pulg.) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (puntas con amplia apertura, 200 µ l) | Biozym | 729055 | |
| cubreobjetos de 12 mm | Thermo Scientific | 0784 #1 |
Referencias
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg ext....
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Reimpresiones y permisos
