Isolement physique des Endospores partir d'échantillons environnementaux par ciblé lyse des cellules végétatives

Résumé

Une méthode permettant de distinguer les endospores bactériennes des communautés microbiennes complexes a été développée pour effectuer des études de culture ou moléculaires sur mesure de ce groupe de bactéries.

Résumé

La formation d’endospores est une stratégie de survie que l’on retrouve chez certaines bactéries de l’embranchement des Firmicutes. Au cours de la formation des endospores, ces bactéries entrent dans un état de repos morpho-physiologique qui améliore la survie dans des conditions environnementales défavorables. Même si les firmicutes endosporulés sont l’un des groupes bactériens les plus fréquemment enrichis et isolés dans les études de culture, ils sont souvent absents des études de diversité basées sur des méthodes moléculaires. La résistance du noyau des spores est considérée comme l’un des facteurs limitant la récupération de l’ADN des endospores. Nous avons mis au point une méthode qui tire parti de la résistance plus élevée des endospores pour les séparer des autres cellules d’une communauté microbienne complexe en utilisant des méthodes de lyse physique, enzymatique et chimique. La préparation d’endospores uniquement obtenue peut être utilisée pour la re-culture ou pour effectuer des analyses en aval telles que l’extraction d’ADN sur mesure optimisée pour les endospores et le séquençage ultérieur de l’ADN. Cette méthode, appliquée à des échantillons de sédiments, a permis l’enrichissement des endospores et, après séquençage, a révélé une grande diversité de formateurs d’endospores dans les sédiments lacustres d’eau douce. Nous nous attendons à ce que l’application de cette méthode à d’autres échantillons donne un résultat similaire.

Introduction

Le but de ce travail est de fournir un protocole pour la séparation des endospores bactériennes partir de cellules bactériennes végétatives dans les échantillons environnementaux. La formation d'endospores bactériennes est une stratégie de survie, généralement déclenchée par la famine, trouvé dans un certain nombre de groupes de bactéries appartenant à l'embranchement des Firmicutes ^1. Bactéries endospores sont bien étudiés, principalement en raison d'un certain nombre de souches sont pathogènes et donc d'une importance médicale (par exemple, Bacillus anthracis ou Clostridium difficile). Souches environnementales ....

Protocole

1. Préparation des produits chimiques et de l'équipement

1. Ajouter 500 ml d'un hexamétaphosphate de sodium à 1% (SHMP) (NaPO _{3) n} solution et stériliser par autoclavage.
2. Stériliser nitrocellulose (NC) filtres (taille de pores de 0,22 um, diamètre 47 mm) par autoclavage en verre fermé des boîtes de Pétri.
3. Stériliser les filtres NC (taille de pores 0,22 pm, diamètre 25 mm) à l'autoclave fermé en verre boîtes de Pétri.
4. Peser et noter le poids à vide des tubes de 50 ml stériles (avec Cap sur) (un tube par échantillon).
5. Préparer Tris-EDTA-tampon (tampon TE) 1x: effectuer solution de Tris 10....

Résultats

Les résultats présentés ici ont été publiés plus tôt ^10,21. S'il vous plaît se référer à ces articles pour l'interprétation de l'environnement et la discussion des données.

La procédure générale est résumée sur la figure 1 et correspond à trois étapes principales: d'abord, la séparation de la biomasse à partir de sédiments ou de toute autre matrice de l'environnement; d'autre part, la destruction de cellules végétatives; et.......

Discussion

La résistance des endospores à des facteurs physico-chimiques agressifs externes (par exemple, la température ou détergents) a été utilisé pour mettre au point une méthode pour séparer les endospores bactériennes à partir de cellules végétales dans des échantillons environnementaux. Ceci est la première méthode complète pour isoler à partir d'échantillons environnementaux endospores d'une manière non-destructive. Les procédés antérieurs pour quantifier, détecter ou analyser endospores dans les .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtres à membrane nitrocellulosique Whatman, 0,2 μ ; taille des pores, 47 mm de diamètre	Sigma-Aldrich	WHA7182004 Aldrich  ;
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane	Sigma-Aldrich	252859 Sigma-Aldrich	CAS 77-86-1
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884 Sigma-Aldrich	CAS  ; 60-00-4  ;
Lysozyme à partir de blanc d’oeuf de poule	Sigma-Aldrich	62971 Fluka	en poudre, CAS 12650-88-3  ;
Homogénéisateur Ultra-Turrax T18 basic	IKA	3720000
Porte-filtres en verre pour 47  ; mm membranes, verre Pyrex	EMD Millipore	XX10 047 00
Pompe à vide chimique	Millipore	WP6122050	220 V/50 Hz
Filtration d’échantillonnage sur collecteur pour 25  ; mm membranes	Millipore	1225 Sampling Manifold	polypropylène
Dnase	New England Biolabs	M0303S	Rnase free
NaOH	Sigma-Aldrich	S5881 Sigma-Aldrich	CAS  ; 1310-73-2  ;
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	Sigma-Aldrich	L3771 Sigma  ;
Filtres à membrane nitrocellulosique Whatman, 0,2 μ ; taille de pores, 25 mm de diamètre	Sigma-Aldrich	WHA7182002 Aldrich