Transformation af Probiotic Gær og deres Recovery fra Mave Immune væv efter oral sonde i mus

Summary

Præsenteret her er en samlet beskrivelse af teknikker, der kan anvendes til at udvikle, transformere, administrere og teste heterologt protein ekspression af de probiotiske gæren Saccharomyces boulardii.

Abstract

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Introduction

Probiotiske mikroorganismer er en spændende potentielt middel til effektivt og økonomisk at levere heterologe proteiner til mavetarmkanalen. Disse organismer er i stand til at overleve passage gennem mave-tarmkanalen endnu ikke kolonisere det ^1, muliggør kontrolleret dosering og begrænse eksponering for lægemidlet udtrykkes. Endvidere mulighed for nemt at konstruere disse organismer til at producere heterologt protein i stor skala gør dem et økonomisk alternativ til syntetiske leveringstid partikler. Men udviklingen af en sådan fremgangsmåde, som for nylig demonstreret ved hjælp en auxotrof stamme af probiotiske gær Saccharomyces boulardii ^2, kræver viden om laboratorieteknikker ikke traditionelt kombineret inden for en given undersøgelse, der spænder fra gær og molekylær biologi teknikker håndtering af dyr og immunologiske metoder. Således selv om de enkelte procedurer beskrevet heri, er ikke i sig selv hidtil ukendtlaboratorieprotokoller, målet med dette manuskript er at præsentere en samlet introduktion til teknikker, der er nødvendige for eksperimentel afprøvning af probiotiske gær som lægemiddeltilførselsvehikler til den murine mavetarmkanalen. Forudsat er en samling af væsentlige protokoller for: 1) generation af auxotrofiske mutant stammer af gær, der nemt kan genetisk manipulerede; 2) transformation af gær kulturer til at udtrykke heterolog protein; 3) indgivelse af rekombinant gær til tarmen via oral sondeernæring; og 4) genvinding af levedygtige rekombinant probiotiske gær fra murine tarmen og vurdering af deres heterolog proteinekspression.

Første, selv om der findes adskillige positive og negative udvælgelsesmetoder til manipulation af gærarter, negativ selektion såsom gennem anvendelse af auxotrofe markører øger både effektivitet og lethed med hvilken gær kan transformeres og selekteres. Positiv selektion af transformanter ved hjælp af antibiotika, i samarbejdentrast, øger omkostningerne ved gær manipulation betydeligt. Endvidere kan valget af gær på antibiotika-holdige faste medier muliggøre øget vækst af utransformerede baggrund kolonier i forhold til udvælgelse af auxotrof gær på syntetisk frafald faste medier (upublicerede observationer). Auxotrofe gær er stammer, som mangler enzymer kritiske for syntesen af ​​essentielle aminosyrer eller uracil. Sådan gær kan kun vokse hvis suppleret med de manglende metabolit eller metabolisk gen, således at negativ selektion, når gær udplades på syntetisk dropout medier, der mangler den væsentlige metabolit. Mange almindeligt anvendte Saccharomyces cerevisiae laboratoriestammer er faktisk allerede auxotrofe mutanter ^3. Industrial, klinisk, og probiotiske gærstammer, er imidlertid typisk prototrofisk med evnen til at syntetisere alle de nødvendige næringsstoffer. At muliggøre en mere effektiv genetisk manipulation af en sådan gær, kan auxotrofe gener selektivt målrettesat generere stammer, der kan vælges uden antibiotika. Specifik målretning af auxotrofe markørgener kan opnås gennem PCR-medieret genafbrydelse afhængige af homolog rekombination eller senere ved CRISPR / Cas9 målretning ^{4 – 6.} Alternativt kan UV-mutagenese hurtigt at generere auxotrofe mutanter selv i gærstammer, for hvilke transformation med multiple plasmider teknisk er vanskeligt ^7. Mens PCR målretning og CRISPR / Cas9 er blevet beskrevet udførligt andetsteds, præsenteret i første del af dette manuskript er en detaljeret protokol, der beskriver en UV mutagenese tilgang til at skabe auxotrofiske stammer, der vil give mulighed for negativ selektion snarere end positiv antibiotisk udvalg af gær transformanter.

Det næste nødvendigt skridt i anvendelsen af ​​sådanne auxotrofe stammer til oral afgivelse af heterologt protein er gær transformation med plasmid-DNA. Siden den første vellykkede transformation af yeast sfæroplaster rapporteret for Saccharomyces cerevisiae i 1978 ⁸ har talrige modifikationer blevet karakteriseret at øge effektiviteten og lethed med hvilken gærart kan modificeres genetisk. Anvendelse af elektroporation for vellykket transformation af DNA i S. cerevisiae blev første gang beskrevet i 1985 ⁹ og er siden blevet forbedret ved tilsætning af 1 M sorbitol inkubation til osmotisk støtteceller ^10. Elektroporation effektivitet har endvidere vist sig at afhænge af gær art og stamme, celle nummer og vækstfase, elektroporation volumen, feltstyrke, og specifikke buffere ^11. Lithiumacetat (LiOAc) transformation, oprindeligt beskrevet af Ito et al. ^12, er blandt de mest almindeligt anvendte transformationsprotokoller da det kræver ikke særligt udstyr. Yderligere analyser viste, at effektiviteten af ​​LiOAc gær transformation øger når celler opsamles i midten af ​​log-faseaf vækst og for varmechok i nærvær af polyethylenglycol (PEG) og DNA ved 42 ° C ^12. Inkubation af hele intakte gær med PEG er væsentlig for effektiv transformation, eventuelt ved at forbedre binding af DNA til cellemembranen samt via andre effekter på membranen ^13. Lithium selv øger også permeabiliteten af intakte celler ^14. Selv om de fleste laboratorium S. cerevisiae-stammer kan let transformeres under anvendelse LiOAc transformation ^3, kan andre gærarter være mere effektivt omdannes ved hjælp af alternative protokoller. Pichia pastoris, for eksempel, er mest effektivt transformeret via elektroporation stedet LiOAc transformation ^13. Det er afgørende, således at teste flere metoder til transformation og optimere inkubationsperioder og reagenskoncentrationer når de forsøger at gensplejse en karakteriseret gærstamme. Dette manuskript beskriver således både LiOAc transformation og elektroporation som teknikker til omdannelse af auxotrofe mutant og vildtype S. boulardii. Interesserede læsere er rettet til de seneste anmeldelser for grundige beskrivelser af udviklingen af gær transformation, alternative protokoller, og yderligere drøftelser af mulige virkningsmekanismer ^13,15. Transformation af gær med plasmid koder for et let påviseligt protein er desuden afgørende for downstream test for at sikre korrekt udtryk og funktion af heterologt protein. Myriad forskellige proteiner kan vælges afhængigt af det endelige formål med den terapeutiske studier og antistofferne tilgængelige for protein detektion ved immunoblotting, ELISA og andre teknikker. Protokoller for disse teknikker er blevet grundigt beskrevet andetsteds ^16,17, og kan anvendes til at bestemme niveauer af heterolog proteinproduktion fra transformeret gær ved sammenligning med standardkurver. Med henblik på demonstration og at visevellykket produktion af et meget almindeligt anvendt protein i gær biologi, dette håndskrift viser transformation med plasmid, der koder grønt fluorescerende protein (GFP), som giver mulighed for efterfølgende påvisning ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

Lige så vigtigt for produktionen af ​​probiotiske organismer, som udtrykker heterologe protein er den korrekte administration og påvisning af disse mikroorganismer i gastrointestinale væv, som beskrevet i del tre og fire. Indgivelse af rekombinant gær via oral sondeernæring muliggør levering af styrede mængder af gær direkte i maven, hvorfra C57BL / 6-mus er naturligvis ude af stand opkastning ^18. Forkert håndtering af dyr og sonde, kan imidlertid føre til esophageal skader og perforering, gastrisk perforation, tracheal administration, og aspiration lungebetændelse ^19,20. Dårlig teknik og erfaring kan desuden øge variationen i murine immunrespons og eksperimenterende results, som er blevet tilskrevet dyr stress på oral sonde ^21,22. Praksis i rette teknik kan således ikke blot svække dyret ubehag, men kan også øge præcisionen af ​​eksperimentelle resultater. Dette manuskript beskriver og demonstrerer håndtering af dyr og oral sonde til administration af kontrollerede doser af rekombinant gær.

Endelig er det vigtigt at fastslå, vellykket levering af rekombinant gær ved at analysere lymfoide væv for tilstedeværelse af gær og heterologt protein. De gastrointestinale immune væv, som kan lettest og forudsigeligt undersøges for tilstedeværelsen af ​​gær er de Peyerske plaques. Peyerske plaques er sekundære lymfoide organer langs tyndtarmen, der er vigtige steder for mucosal immunreaktion induktion ^23. Antigener fra lumen overføres transcellularly gennem microfold (M) celler i epitel og frigives i Peyerske plaques, og derved udsatte vedlægged antigenpræsenterende celler til intestinal lumen indhold. Selvom partikel optagelse over tarmepitelet også kan opnås ved slimceller, er disse celler blevet vist at kun optager partikler mindre end 0,02 um i diameter ^24. Transepitelial dendritter udvides fra CD103 ⁺ dendritiske celler (DC) også optager små partikler fra tarmlumen ^25; men der er i øjeblikket ingen rapporter, som dokumenterer, at CD103 ⁺ DC'er tage op partikler end bakterier. Således intakt probiotiske gær, af gennemsnitlige størrelse mellem 3-6 um i diameter, er mest tilbøjelige til at blive taget op af M-celler og overføres til de Peyerske plaques. Beskrevet her er en protokol for indsamling og screening af Peyerske plaques for levedygtig rekombinant gær, selv om denne procedure også kan let tilpasses til evaluering optagelse af probiotiske bakterier.

Sammenfattende vurdering rekombinant probiotiske gær for levering afrapeutic proteiner til tarmen kræver færdigheder i laboratorieteknikker spænder molekylærbiologi til håndtering af dyr og immunologi. Præsenteret her er protokoller for 1) genereringen og screeningen af ​​auxotrofe gærstammer som let kan selekteres negativt uden antibiotika, 2) alternative protokoller til transformation gær og muliggøre ekspression af heterologt protein, 3) demonstrationer af korrekt håndtering af dyr teknikker og oral sondeernæring til intragastrisk levering af rekombinant gær, og 4) protokoller for Peyerske plak dissektion og screening for levedygtig rekombinant gær og funktionelt heterologt protein. Tilsammen vil disse protokoller muliggøre generering og testning af en probiotisk gærstamme kan levere heterologt terapeutisk protein til mavetarmkanalen.

Protocol

1. UV mutagenese for at generere Auxotrofe gærstammer Generere overlevelseskurver at bestemme nødvendige doser af UV-bestråling Forbered YPD (gærekstrakt pepton dextrose) medier og andre reagenser anført i tabel 1 ifølge standardprocedurer 26 og inokulere enkelte kolonier i 5-10 ml YPD medium. Inkuberes kulturer på en rulle tromle ved 30 ° CO / N til mætning i mindst 8 timer. Bestem cellekoncentration på O / N kulturer under anvendelse af et spektrofoto…

Representative Results

Generering af en overlevelseskurve efter UV-bestråling kræver udpladning af fortyndede gærceller, således at særskilte kolonidannende enheder (CFU) er i stand til at danne. Hver 500 pi prøve opsamles som ovenfor beskrevet indeholder ca. 5 x 10 6 celler; dog større end 100 kolonier per plade er vanskeligt præcist at skelne. Plating ufortyndede prøve samt serielle 1:10 fortyndinger af bestrålede celler sikrer således, at CFU kan opregnes ved hver UV-dosis, som…

Discussion

Sammen protokollerne heri beskriver de væsentlige skridt, der er nødvendige for udvikling og afprøvning af auxotrofiske probiotiske gærstammer til levering af heterolog terapeutisk protein til tarmen. Denne manipulation og afprøvning af rekombinant probiotiske gær kræver teknikker og ressourcer, som enhver person laboratorium kan i øjeblikket ikke være bekendt. selvom mange tidligere undersøgelser har beskrevet ovenstående protokoller for flere gær og musestammer, disse metoder har således ikke til forfatte…

Materials

SmartSpec 3000 Spectrophotometer	BioRad	170-2501	Example of spectrophotometer for determining cell concentration and OD600 of yeast cultures
New Brunswick Roller Drum	Eppendorf	M1053-4004	Example of roller drum for yeast culture incubation
UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075-03	Example stratalinker
Stuart Colony Counter SC6PLUS	11983044	Fisher Scientific	Plate stand with magnification records colony count upon sensing pressure from pen
Scienceware Colony Counter	F378620002	Bel-Art Scienceware	Hand held colony counter pen
Replica plating device	Fisherbrand	09-718-1	Example of replica plating stand and pads
Velveteen squares	Fisherbrand	09-718-2
L shaped sterile cell spreaders	Fisherbrand	14665230
Deoxyribonucleic acid, single stranded from salmon testes	Sigma-Aldrich	D7656-1ML	Example carrier DNA for yeast LiOAc transformation
Gavage needles	Braintree Scientific	N-PK 002	For mice 15-20 g, the suggested needle is a 22 gauge (1.25 mm ball), 1 in long, straight reusable gavage needle. For mice weighing greater than 20 g, 20 gauge or larger straight or curved gavage needles may be used
1mL sterile slip-tip disposable tuberculin syringe	Becton Dickinson	BD 309659
Blunt forceps such as Electron Microscopy Sciences 7" (178 mm) serrated tip, broad grip forceps	Electron Microscopy Sciences	77937-28	Example of blunt forceps needed for dissection
Straight and curved dissection scissors	Electron Microscopy Sciences	72966-02 and 72966-03	Examples of scissors needed for dissection
IMDM	Life technologies	12440053