リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング
Summary
Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.
Abstract
In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.
Introduction
in vivoイメージングでは 、ほとんどの生理的な文脈における細胞の挙動の直接可視化を提供します。ゼブラフィッシュの胚の透明性、その迅速かつ外部の開発と蛍光標識を可能にする遺伝子ツールの豊富なアレイは、すべてのキーの発達のイベントのダイナミクスを解明するためにin vivoでの顕微鏡の利用拡大に貢献しています。ゼブラフィッシュにおける神経系の発達のイメージング研究では、例えば大幅に神経前駆細胞の挙動とそれに続く遊走、分化および回路の集積1-8を含むそれらの子孫の運命の我々の知識を拡大しています。
ステージは、現在、これらの細胞の挙動の基礎となる細胞内動態を調査するために設定されています。確かに、ゼブラフィッシュは、既にin vivoでの細胞生物学のためのツールとして利用されています。ミトコンドリア9-11を可視化できるようになりました2,8,12-14を中心体、ゴルジ15、微小管4およびアクチン細胞骨格16は、17エンドソームおよびin vivoでのゼブラフィッシュ胚における他の細胞内構造の中で、1,18頂端膜の構成成分の複雑な。これまでのところ、これらの細胞小器官の機能について知られていることの多くは、培養細胞中で彼らの行動を研究から来ています。 in vitro試験は、細胞生物学に多大な洞察が得られているが、培養中の細胞は、完全にin vivoでの状況の複雑さを表すものではありませんので、必ずしも生体内での細胞内小器官の機能とダイナミクスを反映するものではありません。ゼブラフィッシュの胚は、細胞内ダイナミクスを調べるためにインビボ代替中の生存を提供しています。
脊椎動物としては、ゼブラフィッシュは、哺乳動物種に見られるものと相同であり、多くの器官系（ 例えば、神経網膜）を有します。さらに、ゼブラフィッシュの胚はますます人間の病気19,20をモデル化するために使用されています</sアップ>、中心体の機能（ 例えば、小頭21およびレーバー先天性黒内障22）とのミトコンドリア機能（ 例えば、パーキンソン病23は 、10,24およびバルト症候群25タウオパチー）に関連するものを含む。細胞および細胞下レベルでのin vivoイメージングこれらの例では、これらの病理学的状態の根底にある細胞生物学のより良い理解を可能にします。
ここに記載された方法の全体的な目標は、 インビボでの光学顕微鏡に用いゼブラフィッシュ胚における器官及び他の細胞内構造を調査するために総合的なガイドを提供することです。 in vivoでの細胞内構造を可視化し、追跡に関わる全体の作業の流れを説明する-遺伝的標識アプローチから、一時的に生成し発現させ、安定したトランスジェニック魚、そして最終的に広視野と共焦点顕微鏡を使用して画像化することに。これらのprocの各一方、eduresは、多数のゼブラフィッシュの研究室で使用されて、記載されているプロトコルは、最適化され、細胞内構造のダイナミクスを調査するための合理化されています。ここで説明する作業の2つの特定の側面は言及に値する：まず、遺伝的に複数の構成でのGal4-UAS発現系の使用は、特定の細胞型における細胞小器官にラベルを付けます。第二に、in vivoでの画像細胞内構造に広視野と共焦点顕微鏡の直接比較。
ゼブラフィッシュにおける遺伝的にラベル細胞小器官および他の細胞内構造への現在の戦略のいずれかにするプロモーター要素が直接融合タンパク質9,14,15。 インビトロ転写キャッピングされたRNAの結果での発現を駆動するキャップされたmRNA 1,4,8またはDNAに基づく構築物の使用しかし、組織特異的ではありません迅速かつ広範な表現、。キャップされたRNAは希釈または分解されるようにさらに、発現レベルは経時的に減少します。 RNAのこのように使用するベース開発の後の段階でオルガネラダイナミクスを調べるために構築する（通常は最大3日後に受精）制限されます。
これらの制限は、発現の空間的および時間的制御は、特定のプロモーターエレメントにより決定されるDNA構築物を使用することによって克服することができます。 DNAベースの構築物のGal4-UASシステムの文脈で使用される場合、導入遺伝子発現レベルに有意な改善が26,27を観察しています。レポーター遺伝子は、Gal4の結合性上流活性化配列（UAS）の下流にクローニングされている間、この二部式システムでは、細胞型特異的プロモーターエレメントは、転写活性化因子GAL4の発現を駆動します。適切なGal4のドライバとUASレポーターを組み合わせることによって、発現が異なるプロモーターの後ろに特異的な発現パターンが所望されるたびに、レポーター遺伝子をクローニングする必要性を回避し、特定の細胞型に限定することができます。また、複数のUASレポーター遺伝子の発現をすることができ単一のGal4活性化因子によって駆動されます。 Gal4-UASシステムは、このように細胞内標識化のための汎用性と柔軟な遺伝的なアプローチを提供します。
広い視野と共焦点顕微鏡は、ほとんどの研究室の主力です。広視野システムは、典型的には、光源として、アークランプを使用して、光路の端部に配置されている敏感なカメラで放射された光を検出します。アウトオブフォーカスライトは、厚い試料での合焦情報を覆い隠すように、このイメージングモダリティは、典型的には、薄いサンプルに制限されています。共焦点顕微鏡は、彼らが焦点（ すなわち 、「光学切片」）28のうち、発信するものの上に焦点面からの発信信号を優先するように構築されているという点で、広視野システムとは異なります。光学セクショニングを達成するために、ピンホールは、点光源に共役な位置に排出経路に配置されます。レーザーが光源として使用され、信号は、光電子増倍管（PMT）で検出されます。具体的には、レーザービームは、試料によってポイントツーポイント及び各スポット（ピクセル）での蛍光発光は、PMTによって検出さにわたって通されます。
ここでは画像の両方顕微鏡モダリティの直接比較を提供するために、広視野および共焦点顕微鏡法の両方を使用してゼブラフィッシュ胚生体において全く同じ細胞内構造。このような比較を提供する基礎となる目的は、手元の特定の質問に最も適切な顕微鏡技術を選択するためのガイドラインを提供することです。
ここで説明する手法を用いて、我々は、ミトコンドリアと中心体ののGal4 UASベースの遺伝的標識化を実証します。これらの細胞小器官は、各撮像モダリティの適合性を実証するために広視野共焦点顕微鏡を用いて、神経系の異なる細胞型内および筋肉細胞内に結像されます。ここで説明する方法は、容易に生きたゼブラフィッシュ胚における他の細胞小器官および細胞内構造を調査するために適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、蛍光タグミトコンドリア、中心体とゼブラフィッシュ胚のin vivoで特定の細胞型の細胞膜へのGal4-UAS発現系の汎用性を実証します。他の細胞小器官または細胞内構造を標識する多数の蛍光融合タンパク質は、公表された文献に見出すことができ、それぞれの実験室、商業的供給源または非商業的なプラスミド寄託（ 例えば、Addgene）から得ることができます。新?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.’s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich “Molecular Mechanisms of Neurodegeneration” (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community’s Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 “Assembly and Function of Neuronal Circuits”, Project A11.
We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich – DZNE) for contributing to the development of MitoFish.
Materials
| Agarose (2-hydroxyethylagarose) | Sigma-Aldrich | A4018-10G | Low-gelling temperature Type VII |
| Block heater | Eppendorf | Thermomixer compact | |
| Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996% | Aldrich | 202967-50g | To prepare 30x Danieau's |
| CCD camera | Qimaging | Retiga Exi Fast 1394 | |
| Ceramic Coated Dumont #5 Forceps | Dumont – Fine Science Tools | 11252-50 | #5 Forceps |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000 Fluoview | |
| Culture dish heater | Warner Instrument Corporation | DH-35 | Heating ring |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt | Fluka Analytical | A5040-100G | Tricaine (anesthetic) |
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | M205 FA | |
| GeneClean kit | MP Biomedicals | 111001200 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | 35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass |
| Glass needles | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | For microinjections |
| HEPES | Sigma | H3375-250g | To prepare 30x Danieau's |
| High vacuum grease | Dow Corning | DCC000001242 150g | Silicon dioxide grease |
| Incubator | Thermo Scientific | Heraeus | To maintain zebrafish embryos at 28.5⁰ C |
| KCl 99% | Sigma-Aldrich | S7643-5kg | To prepare 30x Danieau's |
| MgSO4.7H2O Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent | Sigma-Aldrich | 230291-500g | To prepare 30x Danieau's |
| Microinjector | Eppendorf | FemtoJet | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | 0.5-20uL |
| Micromanipulator | Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R | |
| Micropipette holder | Intracel | P/N 50-00XX-130-1 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | To transcribe PCS-Transposase |
| NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | To prepare 30x Danieau's |
| Nanophotometer | To measure DNA/RNA concentration | ||
| Needle puller | Sutter Instrument | P-1000 | Flaming/Brown |
| NIR Apo 40x/0.80W | Nikon | Water-dipping-cone objective | |
| N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% | Sigma | P7629-10G | PTU (prevents pigmentation) |
| Petri dishes | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16mm |
| Plastic molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | For microinjections |
| Plexiglas cover-with a hole | Custom-made | The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective | |
| Tea-strainer (Plastic) | To collect zebrafish eggs | ||
| Temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | Dual Automatic Temperature Controller |
| Transfer pipettes | Sarstedt AG | 86.1171 | 3.5mL plastic transfer pipettes |
| UMPlanFI 100x/1.00W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
| UMPlanFLN 20x/0.50W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
| Widefield microscope | Olympus | BX51WI | |
| PTU (50x Stock) | Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water Stir vigorously at room temperature Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
||
| Tricaine (20x Stock) | Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water Add 2 ml 1M Tris base (pH9) Adjust to pH 7 Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
||
| Danieau's Solution (30x Stock) | 1740 mM NaCl <21 mM KCl 12 mM MgSO4.7H2O 18 mM Ca (NO3)2 150 mM HEPES buffer Distilled water upto 1 L Store at 4 oC Use at 0.3x working solution |
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