Abstract
Voor de meeste zoogdieren pathogenen, zijn gene expression profiling studies beperkt door technische moeilijkheden om nauwkeurig te kwantificeren pathogeen gentranscripten van geïnfecteerde weefsels. Pathogeen RNA vormt een klein deel van het totale RNA geïsoleerd van geïnfecteerde weefselmonsters. Zowel microarray en RNAseq technologieën hebben problemen bij het genereren van betrouwbare leest voor zwak uitgedrukt pathogeen genen. Gemuteerde ziekteverwekker stammen met verminderde in vivo proliferatie vormen een nog grotere uitdaging. Hier beschrijven we een in vivo gene expression profiling protocol dat is erg snel, zeer gevoelig en zeer reproduceerbaar. We ontwikkelden dit protocol tijdens ons onderzoek naar de schimmel pathogeen Candida albicans in een muizenmodel van hematogeen verspreid candidiasis. Met behulp van dit protocol, hebben we de tijd cursussen van dynamisch geregeld C. gedocumenteerd albicans genexpressie tijdens nierbesmetting en ontdekte onverwachte eigenschappen vangenexpressie reacties op de behandeling met geneesmiddelen antifungale in vivo.
Introduction
Genexpressie dynamiek houdt vitale informatie over hoe een cel reageert op veranderingen in het milieu. Bij een infecterende microbe kan genexpressiedata klinisch relevante inzichten over een pathogeen zich aanpast aan de infectie milieu en veroorzaakt schade aan de gastheer te verschaffen. In de afgelopen twee decennia hebben genexpressie studies zowel in vitro als in vivo grote hoeveelheid gegevens gegenereerd en legde de basis voor het begrijpen van de infectie biologie 1-3. Echter, de huidige profilering technologieën zoals microarray en RNAseq, zijn niet optimaal voor de profilering van pathogeen genexpressie tijdens infectie. Host RNA vormt overgrote deel (gewoonlijk> 99%) van het totale RNA geïsoleerd van geïnfecteerde weefselmonsters. De gastheer RNA draagt bij aan de hoge achtergrond op microarrays, en domineert volgorde leest van RNAseq. Pathogeen celisolatie uit geïnfecteerd weefsel, in theorie, kunnen helpen verrijken pathogeen RNA, maar het vormt aanvullingal problemen: het vereist grote hoeveelheden van geïnfecteerde weefsel; de procedure kan vervelend zijn; en het belangrijkst, is het moeilijk om de natieve toestand of integriteit van RNA behouden gedurende het langdurige proces. Om meer uitgebreide en nauwkeurige gegevens over pathogeen genexpressie tijdens echte infecties te genereren, we wilden een protocol dat betrouwbare en kosteneffectieve kwantificering van minderheden RNA soorten laat in een gemengde populatie RNA te ontwikkelen.
NanoString NCounter is een recent ontwikkelde platform dat rechtstreekse multiplex meting van genexpressie maakt gebruik van digitale barcode probeparen 4, 5. Dit platform heeft een gevoeligheid niveau dat vergelijkbaar is met dat van QRT-PCR maar niet enzymatische versterking nodig. De techniek is niet genoombrede, laat detectie van maximaal 800 verschillende genen in elke assay. Daarom is het essentieel om informatieve genen als probes voor profilering selecteren. Hier gebruiken we profilering van genexpressie studie van een belangrijke bromeen pathogeen, Candida albicans, gedurende een invasieve infectie als voorbeeld aan te tonen: 1) Technische details van de experimentele procedures (protocol), 2) de gevoeligheid, reproduceerbaarheid en dynamisch bereik van deze methode (representatieve resultaten), en 3) Belangrijke overwegingen voor het ontwerpen en uitvoeren van experimenten op basis van dit protocol (discussie). Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor verschillende pathogenen en is met succes in verschillende infectiemodellen 6-9 toegepast.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op de Los Angeles Biomedical Research Institute (protocol 011.000) en volgens de National Institutes of Health (NIH) richtlijnen voor de ethische behandeling van dieren uitgevoerd. De muizen werden gehuisvest in een AAALAC-geaccrediteerde faciliteit gevestigd op de campus van Harbor-UCLA Research and Education Institute. Een full-time dierenarts die gespecialiseerd is in het laboratorium dierlijke geneeskunde overzag hun zorg. Kooien en veeteelt werd verstrekt volgens de richtlijnen van de US Public Health Service publicatie "Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren". Iedere poging werd gedaan om de muizen op een humane manier te behandelen. De overleving en de gezondheid van de muizen werd driemaal dagelijks gevolgd. Uiteraard werden ziek, lethargisch muizen gescheiden van de groep en gedood om het lijden te minimaliseren. De muizen werden gedood door een overdosis pentobarbital (210 mg / kg), zoals aanbevolen door het Panel on Euthanasia van de American Veterinary Medical Association.
1. Voorbereiding van de weefsels, reagentia en instrumenten
- Gebruik mannelijke Balb / c-muizen met een gewicht 20-22 g voor alle onderzoeken. Te enten drie muizen per experimentele groep intraveneus met 1 x 10 6 gist-fase C. albicans cellen. Offeren van dieren en oogsten nieren op specifieke tijdstippen na infectie. Plaats elke nier in een schroefdop buis snap bevriezen in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 ° C voor latere RNA-extractie 6.
Opmerking: De dierproeven werden uitgevoerd zoals beschreven in Xu et al. 6. - Bereid de volgende reagentia en instrumenten voor het verwijderen van de nieren van de -80 ° C vriezer:
- Open een totaal RNA-extractie kit. Voeg 2-mercaptoethanol (1% v / v) om RLT buffer en meng goed (voorbereiden 2 ml voor elk monster).
- Bereid fenol: chloroform: isoamylalcohol 25: 24: 1 (moet 600 ul voor elk monster).
- Label M-type homogenisering buizen (M-buis) en chill op ijs.
- Label 2 ml schroefdop buizen en voeg ongeveer 300 ul Zirconia kralen aan elke buis.
- Controle-instrumenten zijn beschikbaar: weefsel dissociator, BeadBeater, tafelblad centrifuge met adapters voor 50 ml buizen en platen met 96 putjes, fotometer.
2. RNA-extractie van geïnfecteerde weefsels
- Verwijder buisjes met nieren van -80 ° C vriezer en op ijs gezet. Voeg 1,2 ml buffer RLT met 2-mercaptoethanol aan elke nier. Giet de nieren met buffer in een M-type homogenisering buizen.
- Homogeniseren van de nieren met een tissue dissociator op vooraf geladen instelling RNA_02.01.
- Centrifugeer bij 1000 g gedurende 1 min in een tafelblad centrifuge bij kamertemperatuur.
- Transfer 600 ul homogenaat aan de schroefdop buis met Zirconia kralen. Sla de resterende homogenaat op ijs.
- Voeg 600 ul fenol: chloroform: isoamylalcohol 25: 24: 1 totde buizen uit de vorige stap.
- Sluit de deksels stevig en vortex op BeadBeater gedurende 3 minuten in een 4 ° C koude kamer.
- Centrifugeer de buisjes bij 15.000 g gedurende 5 min in een 4 ° C koude kamer.
- Breng voorzichtig de waterige fase naar een nieuwe 1,5 ml microfuge buis goed mengen met een gelijk volume van 70% ethanol, vervolgens laden op de spin kolom (load tweemaal).
- Was de spin kolom eenmaal met 700 ui buffer RW, gevolgd door tweemaal met 500 ul buffer RPE. Centrifuge één extra minuut in een droge verzameling buis om de resterende vloeistof in de spin kolom te verwijderen. Voer alle stappen centrifugeren bij 8.000 x g.
- Elueer RNA met 50 ui H2O Meet RNA concentratie OD 260 met een spectrofotometer.
3. Gene Expression Profiling Met behulp van Digital Bar-codering
- Dooi reporter codeset (groene dop buis) en vastleggen codeset (grijze dop buis) op ijs.
- Voeg 130 ul hybridisatiebuffer de reportier codeset, omkeren om te mengen en spin down.
- Voeg 20 ul van het mengsel voor elk van de 12 reageerbuisjes.
- Voeg 10 ug totaal RNA weefsel (in een volume van 5 ui) aan elke buis. Meng door pipetteren.
- Voeg 5 ul capture codeset aan elke buis. Meng door omkeren van de buis, gevolgd door een snelle draai naar beneden.
- Incubeer de reacties bij 65 ° C in een thermocycler met een verwarmd deksel O / N (= 18 uur).
- Verwijder een sample cartridge van -20 ° C en laat het warm tot kamertemperatuur.
- Verwijder twee reagentia platen van 4 ° C en centrifugeer bij 670 xg gedurende 2 min in een tafelblad centrifuge.
- Stel de prep station volgende stap-voor-stap instructies op het scherm, selecteert u de optie hoge gevoeligheid.
- Verwijder de reacties van de thermische cycler en direct geladen op prep station. Selecteer de hoge gevoeligheid-programma (3 uur) lopen.
- Wanneer de prep station programma is voltooid, verwijdert u de cartridge en sluit de rijstroken met een duidelijke band. Apply minerale olie aan de bodem van de patroon (voor opwekking één Ncounter alleen latere generaties deze stap niet vereist), dan laadt de cartridge op de digitale analyser.
- Stel de digitale analyser volgende stap-voor-stap instructies op het scherm, selecteert u de scan optie hoge resolutie.
- Selecteer de hoge resolutie-optie (600 velden), voert u het scanprogramma (~ 4,5 uur).
- Wanneer het scannen programma is voltooid, het downloaden van de resultaten (of ervoor kiezen om de resultaten per e-mail), en ruwe data te importeren in de software van de fabrikant. De software controleert automatisch de kwaliteit van gegevens en vlaggen te verhogen als de kwaliteit van de data valt buiten het normale bereik. Voeren technische aanpassing met behulp van de ingebouwde functie (optioneel, volg de instructies in de software), dan is de uitvoer van de gegevens als een Excel-bestand.
- Normaliseren van de gegevens met behulp van een van de volgende manieren: totaal telt van alle genen in de codeset; één of enkele interne controle genen; geometrisch gemiddeldevan sterk uitgedrukt genen (zie bespreking).
- Bereken de gemiddelde waarden expressie voor elk gen (indien het experiment werd uitgevoerd in duplo of triplo), dan berekent de verhouding van expressieniveaus tussen de verschillende experimentele groepen.
- (optioneel) Analyseer en visualiseren profilering resultaten van ingebouwde functies in de nSolver software of clustering programma zoals MultiExperiment Viewer 10.
Representative Results
Een van de belangrijkste uitdaging voor de ziekteverwekker profilering van genexpressie in vivo is om genoeg leest van pathogeen RNA. Gezien het lage percentage pathogeen transcripten in totaal RNA, grote hoeveelheid totaal RNA (> 10 g) worden gebruikt per reactie. Het platform heeft een uniek voordeel in dit verband: het gebruikt zowel een vangprobe en een verslag probe om de specificiteit te verhogen, zodat de overweldigende hoeveelheid gastheer RNA veroorzaakt geen significante geluidsniveau. Zoals getoond in Figuur 1 (aangepast van Ref. 6), achtergrond ruwe tellingen uit een geïnfecteerde weefselmonster (rode stippen) waren dan 10, terwijl ruwe tellingen uit twee geïnfecteerd weefselmonsters (blauwe stippen) waren allemaal boven 10. Expression data gegenereerd het gebruik van dit protocol zijn zeer reproduceerbaar. Zoals getoond in Figuur 1 (aangepast van Ref. 6), ruwe tellingen uit twee biologische replicaten (blauwe stippen, 48 uur na infectie niermonsters) had zeer kleverige massad correlatie, met R-kwadraat waarde is gelijk aan 0,945. Het platform biedt ook voldoende dynamisch bereik voor natuurlijke biologische expressie omvatten (figuur 1, ruwe tellingen varieerde tussen 10 1 en 10 6).
Met behulp van een probe set specificeren 248 milieu respons genen, konden we twee fasen van pathogeen genexpressie (figuur 2, aangepast van Ref. 6) te onderscheiden: een vroege genexpressie respons omvat genen met RNA niveaus significant verschillend tussen inoculum en 12 uur na infectie samples (P <0,05 en> 2-voudige verandering in expressie) en een late genexpressie respons omvat genen met RNA niveaus die aanzienlijk verschillen tussen de 12 uur tijdpunt 48 uur na infectie samples (P <0,05 en> 2-voudige verandering in expressie). Deze resultaten geven aan dat C. albicans genexpressie wordt dynamisch gereguleerd tijdens invasieve infection een zoogdiergastheer.
Figuur 1. Raw telt van geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde nierweefsels (aangepast van Ref. 6). Probe telt voor twee besmette (48 uur na infectie, blauwe data punten) en één niet-geïnfecteerde (rood data punten) nieren monsters worden gepresenteerd als een scatter plot. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Expressie van C. albicans milieuvriendelijke responsieve genen tijdens de invasieve infecties (aangepast van Ref. 6). Veranderingen in expressie niveaus tijdens de muis nier invasie voor 248 C. albicans genen worden in een warmte-map formaat. Gemiddelde waarden van biologische triplo worden getoond voor opwaartse regulatie (geel) en neerwaartse regulatie (blauw) van genen 12, 24 en 48 uur na infectie opzichte inoculumniveaus (0 uur) betekenen. Kleurverzadiging vertegenwoordigt de omvang van de uitdrukking veranderen, met volledige verzadiging bij 10 voudig op- of neerwaartse regulering. Delen van de warmte-kaart zijn geëxpandeerd ter illustratie representatieve vroege genen opgereguleerd (boven), late genen (midden), en vroege genen neerwaarts gereguleerd (onder). In deze delen, worden individuele monsters afzonderlijk gepresenteerd te illustreren reproduceerbaarheid. We definiëren vroege veranderingen uitdrukking als significante verschillen tussen inoculum en 12 uur monsters. We definiëren late wijzigingen uitdrukking als significante verschillen tussen de 12 en 48 uur monsters. Significantie verwijst naar veranderingen van> 2 maal en een p-waarde <0,05. De gegevens voor elk monster werden genormaliseerd om RNA niveaus van controle-gen TDH3 voordat gemiddelde waarden werden berekend. Onze opdracht criteria toelaten dat sommige dynamically gereguleerde genen te vallen in zowel de vroege en late klassen expressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit protocol is ontwikkeld om transcriptionele profilering van infecterende microben met een NanoString Ncounter platform optimaliseren. De gehele procedure van weefselverzameltoestel expressie van gegevens, vereist minder dan 48 uur. De hands-on is ongeveer 4 uur voor 12 monsters. Een belangrijke variabele in dit protocol is de hoeveelheid buffer RLT toegevoegd aan het weefsel bij de eerste stap. Te veel buffer zal het homogenaat verdunnen en leiden tot RNA-concentratie te verlagen, terwijl er te weinig buffer kan leiden tot de vorming van viskeuze gels na de fenol chloroform extractiestap en laten geen waterfase voor RNA-herstel. De empirisch bepaalde optimale volumina buffer RLT voor muisweefsels (uitgaande gangbare afmetingen) zijn: nier (1,2 ml), tong (1,0 ml) en long (2,0 ml). Voor microbiële ziekteverwekkers, vooral deze geteeld in filamenteuze vorm, de kraal verslaan stap helpt om open te dikke celwand te breken om de cellulaire inhoud volledig vrij te geven. In de elutiestap, teneinde de uiteindelijke RNA vergrotenconcentratie, kan de eerste ronde eluaat opnieuw worden toegevoegd aan de kolom en elueer nogmaals. Ongeveer 100 ug totaal weefsel RNA kan worden teruggewonnen van de ene RNeasy spin-kolom (~ 2 ug / ul x 50 pi). Indien grotere hoeveelheid RNA nodig kan een tweede prep worden uit de overblijvende weefsel homogenaat. Gooi de resterende homogenaat tot RNA-concentratie is gemeten, voor het geval.
Afhankelijk van het infectiemodel, het inoculum en het pathogeen stam het percentage pathogeen RNA in totaal RNA weefsel varieert van 0% -2%, en typisch valt onder de 0,05% -0,5% bereik. Bijvoorbeeld, 10 pg totaal RNA uit weefsels C. albicans besmette nier ruwe tellingen gelijk aan die van 10 ng zuivere C. kunnen genereren albicans RNA van een in vitro kweek (10 ng / 10 g = 0,1%). Door het percentage pathogeen RNA in totaal weefsel RNA varieert in een groot, is het moeilijk om de hoeveelheid pathoge wetenn RNA in een bepaalde hoeveelheid van totaal RNA. Om verspilling codeset vermijden (250 x 192 genen reacties, de kosten per reactie ongeveer $ 200) op monsters met pathogeen RNA beneden het detectieniveau, kan een RNA kwaliteitscontrole stap worden uitgevoerd om het pathogeen RNA niveau in elk monster te bepalen. Dit kan door een Q-RTPCR of klein codeset met enkele housekeeping genen.
Normalisatie gebruik pathogeen genen is een belangrijke stap voor de expressie profielen te vergelijken tussen verschillende monsters. Er zijn drie gebruikelijke werkwijzen voor normalisatie. 1. Gebruik totaal telt van alle genen in de codeset. 2. Gebruik één of enkele 'housekeeping' genen. 3. Gebruik de geometrisch gemiddelde (Nde wortel van het product van de N getallen) van sterk tot expressie gebrachte genen. Voor een grote codeset (> 100 genen) die willekeurig gekozen probes, met behulp van totale tellingen voor normalisatie kan een goede keuze, omdat de totale tellingen van een groot aantal ongerelateerde genen geloofovereen met het aantal RNA-ingang. Voor een kleine codeset (<100 genen) probes gericht op een specifieke werkwijze (zoals hyfen groei, aangezien hyfen groeigenen vaak mede-gereguleerde), één of enkele housekeeping genen als controle voor de normalisatie van essentieel belang. TDH3, een robuust uitgedrukt metabole gen, heeft goed diende als controle voor vele experimenten. De derde methode is een hybride van werkwijze 1 en 2, met de nadruk op gelijke bijdrage uit sterk tot expressie gebrachte genen.
Hoewel de NCounter platform niet wordt genoom-brede, staat het kwantificeren van meningsuiting niveau tot 800 genen in een enkele test. Daarom is het kiezen van de meest informatieve genen te analyseren is essentieel voor het slagen van de profilering. Twee benaderingen te selecteren op probes werden gebruikt. De eerste benadering is "kenniseconomie". Informatie van gepubliceerde expressie en functionele gegevens zijn samengesteld voor het screenen op genen die van potentieel belang zijn voor de huidigebestuderen, zoals het milieu respons genen 6-9. Deze aanpak maakt een eenvoudige vergelijking van de in vivo data profiling te veel bestaande datasets, dus het verstrekken van context interpretatie van gegevens. De tweede benadering is "verkenning gebaseerd". Een categorie van genen in een microbe genoom, zoals alle genen die transcriptiefactoren, kinases of celwand eiwitten gekozen probes. Deze benadering maakt de identificatie van nieuwe virulentiefactoren en ontdekking van nieuwe regulerende relaties op basis van de in vivo profielgegevens 6.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door NIH subsidies R21 DE023311 (APM), R56 AI111836 (APM en SGF), R01 AI054928 (SGF) en R01 DE017088 (SGF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyl Biotec | 130-093-235 | |
| gentelMACS M tube | Miltenyl Biotec | 130-093-236 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M-3148 | |
| Phenol:CHCl3:IAA | Sigma | P-2069 | |
| Zirconia beads | Biospec Products | 11079110zx | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec Products | 607 | |
| nCounter Analysis system | nanoString Technologies | ||
| nCounter Gene Expression Codesets | nanoString Technologies | ||
| nSolver Analysis tool | nanoString Technologies |
References
- Cairns, T., Minuzzi, F., Bignell, E.
- Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Dual RNA-seq of pathogen and host. Nat Rev Microbiol. 10 (9), 618-630 (2012).
- Creecy, J. P., Conway, T. Quantitative bacterial transcriptomics with RNA-seq. Curr Opin Microbiol. 23C, 133-140 (2015).
- Geiss, G. K., et al. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. Nat Biotechnol. 26 (3), 317-325 (2008).
- Malkov, V. A., et al. Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System. BMC Res Notes. 2, 80 (2009).
- Xu, W., et al. Activation and Alliance of Regulatory Pathways in C. albicans during Mammalian Infection. PLoS Biology. 13, e1002076 (2015).
- O'Meara, T. R., et al. The Cryptococcus neoformans Rim101 Transcription Factor Directly Regulates Genes Required for Adaptation to the Host. Mol Cell Biol. 34 (4), 673-684 (2014).
- Cheng, S., et al. Profiling of Candida albicans Gene Expression During Intra-Abdominal Candidiasis Identifies Biologic Processes Involved in Pathogenesis. J Infect Dis. 208 (9), 1529-1537 (2013).
- Fanning, S., et al. Divergent Targets of Candida albicans Biofilm Regulator Bcr1 in Vitro and In Vivo. Eukaryot Cell. 11 (7), 896-904 (2012).
- Saeed, A. I., et al. TM4: a free, open-source system for microarray data management and analysis. Biotechniques. 34 (2), 374-378 (2003).
