Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
इस विधि के समग्र लक्ष्य को सटीकता से बाह्य प्रवाह विश्लेषण का उपयोग कोशिकाओं की ग्लाइकोलाइटिक दर को मापने के लिए है। बाह्य अम्लीकरण का उपयोग कर ग्लाइकोलाइटिक दर के मात्रात्मक माप कई प्रयोगों के वांछित समापन बिंदु है। हालांकि, बाह्य अम्लीकरण की कुल दर दो घटकों का योग है: श्वसन अम्लीकरण, सीओ (2 3 सीओ तो HCO 3 को विघटित एच हाइड्रेट्स जो – + एच +) 2 के रूप में, और ग्लाइकोलाइटिक अम्लीकरण, फार्म में + एच + – लैक्टेट की।
कुल बाह्य अम्लीकरण के लिए सीओ 2 के योगदान को हाल ही में जब तक यहां इस्तेमाल किया माप मंच, XF24 विश्लेषक 7 में नगण्य माना गया है। हालांकि, यह 2 बाह्य अम्लीकरण 4-5 करने के लिए एक बड़ा योगदान हो सकता है कि सह कई अन्य प्रणालियों में स्पष्ट है। एकाधिक कागजात इस चोर को स्वीकार करते हैंयोगदान है, लेकिन एसिड 3,8,9 व्युत्पन्न सीओ 2 के प्रत्यक्ष quantitation के प्रयास नहीं करते। हमने हाल ही में कहा कि सीओ 2 उत्पादन इस प्रणाली 6 में बाह्य अम्लीकरण का एक महत्वपूर्ण स्रोत है मात्रात्मक प्रदर्शन किया। ग्लूकोज अपचय से सीओ 2 उत्पन्न कि कई चयापचय मार्ग देखते हैं, हालांकि इसके अलावा, उन साइट्रिक एसिड चक्र में मैट्रिक्स डीहाइड्रोजनेज द्वारा बाहर किए गए भारी योगदान कर रहे हैं और सभी अन्य स्रोतों प्रयोगात्मक त्रुटि 6 के भीतर हैं कि सीओ 2 की मात्रा में उत्पन्न।
सीओ 2 उत्पादन के लिए संशोधन के बिना, बाह्य अम्लीकरण इसलिए ग्लाइकोलाइटिक दर की एक अस्पष्ट संकेत है और मात्रात्मक इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। हमारे पिछले प्रकाशन श्वसन सीओ 2 भी आम तौर पर मुख्य रूप से ग्लाइकोलाइसिस 6 का उपयोग करने के लिए माना कोशिकाओं में, कुल अम्लीकरण संकेत के थोक शामिल कई उदाहरण हैं जहां पर प्रकाश डाला गया। इसके अतिरिक्त,कुल अम्लीकरण के लिए श्वसन सीओ 2 योगदान एक प्रयोग के अलग-अलग हिस्सों के दौरान ग्लाइकोलाइटिक दर की सही तुलना सीओ 2 के लिए सुधार की आवश्यकता है कि प्रदर्शन, सामान्य चयापचय की रूपरेखा प्रयोगों के दौरान व्यापक रूप से भिन्न होता है।
बाह्य अम्लीकरण की दर का उपयोग कोशिकाओं की ग्लाइकोलाइटिक दर को मापने के लिए, यह उत्पन्न कुल एच + में परिवर्तन करने के लिए पीएच परिवर्तन परिवर्तित करने के लिए, और साइट्रिक एसिड चक्र के संचालन के दौरान जारी सीओ 2 की वजह से बाह्य अम्लीकरण घटाना करने के लिए आवश्यक है। यहाँ, हम (ओ 2 एकाग्रता में बाह्य परिवर्तन से) और सीओ 2 उत्पादन (पीएच में बाह्य परिवर्तन और calibrated परख माध्यम की बफरिंग सत्ता से) बाह्य प्रोटॉन उत्पादन की दर को मापने के लिए एक सरल विधि का वर्णन है, और ग्लाइकोलाइटिक दर की गणना करने के लिए प्रदर्शन इन माप का उपयोग।
इस विधि ताकत लैक्टेट उत्पादन द्वारा परिभाषित के रूप में ठीक से ग्लाइकोलाइटिक दर की गणना करने के लिए इसे का उपयोग करके बाह्य अम्लीकरण माप की उपयोगिता ens। श्वसन सीओ 2 (या लैक्टेट के प्रत्यक्ष माप) के लिए सुधार के बिना, यह निर्धारित करने के लिए असंभव है और यदि कुल अम्लीकरण दर लैक्टेट उत्पादन का एक सीधा माप के रूप में कुल बाह्य अम्लीकरण का उपयोग करने वाले प्रयोगों की व्याख्या confounding, ग्लाइकोलाइटिक दर को दर्शाता है किस हद तक।
गणना
सीओ 2 और लैक्टेट प्रयोगात्मक त्रुटि के भीतर कर रहे हैं, myoblast कोशिकाओं 6 के साथ प्रयोगों के आधार पर बाह्य एसिड का उत्पादन करने के लिए केवल दो योगदानकर्ताओं। इसलिए, कुल बाह्य अम्लीकरण (पीपीआर, प्रोटॉन उत्पादन की दर) की दर के रूप में परिभाषित किया जा सकता है:
पीपीआर मुन्ना = पीपीआर resp + पीपीआर glyc 1 समीकरण
। _content "> जहां मुन्ना = कुल; resp = श्वसन; glyc = ग्लाइकोलाइटिक ग्लाइकोलाइटिक पीपीआर इस प्रकार है:पीपीआर glyc = पीपीआर मुन्ना – पीपीआर resp 2 समीकरण
यहां,
पीपीआर मुन्ना = ECAR मुन्ना / बी पी 3 समीकरण
जहां ECAR = बाह्य अम्लीकरण दर (मील प्रति घंटे / मिनट), और बीपी = बफरिंग शक्ति (मील प्रति घंटे / pmol एच + 7 μl में) है, जबकि
पीपीआर resp = (10 पीएच-PK 1 / (1 + 10 पीएच-PK 1)) (अधिकतम एच + / ओ 2) (ओसीआर मुन्ना – ओसीआर सड़ांध / MYX) समीकरण 4
जहां कश्मीर 1 = 2 सीओ हाइड्रेशन और HCO से 3 हदबंदी के संयुक्त संतुलन निरंतर – + एच +; अधिकतम एच + / ओ 2 = वेंई सह ऐसे ग्लूकोज 6 की पूरी ऑक्सीकरण के रूप में एक विशेष चयापचय परिवर्तन के लिए 2 व्युत्पन्न अम्लीकरण; ओसीआर = ऑक्सीजन की खपत की दर (pmol 2 हे / मिनट), और ओसीआर सड़ांध / MYX = गैर माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर।
4 समीकरण (माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन जहर rotenone और myxothiazol के लिए प्रतिरोधी है कि ओसीआर के रूप में परिभाषित) और अधिकतम एच के लिए खातों + प्रत्येक सब्सट्रेट (अधिकतम एच + / ओ 2 के लिए भस्म हे 2 प्रति उत्पन्न किसी भी गैर-माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर घटाकर माइटोकॉन्ड्रियल ओसीआर आइसोलेट्स ) (6) को देखने के लिए, साथ ही प्रयोगात्मक तापमान और पीएच (10 पीएच-PK 1 / (1 + 10 पीएच-PK 1 में एच + को जन्म देने के सीओ 2 के अनुपात में)। ग्लूकोज का पूरा ऑक्सीकरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल आक्सीजन खपत की दर (ओसीआर) सीओ 2 उत्पादन की दर को बिल्कुल बराबर है। बाह्य प्रवाह माप की सीमित परख मात्रा में सीओ 2 का उत्पादनश्वसन द्वारा घ परख माध्यम में फंस बनी हुई है। + एच + – फंस सीओ 2 में से अधिकांश तो HCO 3 को विघटित होकर जो एच 2 3 सीओ, को हाइड्रेटेड है। एक छोटा सा अंश भंग रहता है, लेकिन हाइड्रेटेड नहीं, और HCO 3 करने के लिए सीओ 2 हाइड्रेशन और हदबंदी के संयुक्त संतुलन निरंतर द्वारा thermodynamically निर्देशित के रूप में एक और छोटा सा अंश, हाइड्रेटेड लेकिन अलग नहीं है – + एच + प्रयोगात्मक तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और पीएच पर (~ 7.4)।
इस प्रकार, पीपीआर मुन्ना है से पीपीआर resp घटाकर पीपीआर जी की गणना के लिए पूरा समीकरण:
पीपीआर glyc = ECAR मुन्ना / बीपी – (10 पीएच-PK 1 / (1 + 10 पीएच-PK 1)) (अधिकतम एच + / ओ 2) (ओसीआर मुन्ना – ओसीआर सड़ांध / MYX) 5 समीकरण
मैंn इस तरह से, श्वसन और ग्लाइकोलाइसिस, साथ ही उनके संबद्ध एटीपी उत्पादन दर की दरों, मात्रात्मक सीधा माप (ऑक्सीजन की खपत, बाह्य अम्लीकरण, प्रतिरोधक क्षमता) और अन्य आवश्यक मूल्यों का आयात या गणना (एच + / ओ 2 से निर्धारित किया जा सकता , पी / हे, और संतुलन निरंतर कश्मीर 1) 6। यहाँ वर्णित प्रयोग कुंजी XF24 10,11 के रूप में बाह्य प्रवाह विश्लेषक इस तरह के प्रयोग करने के लिए मानक तकनीक पर फैलता है; अन्य बाह्य प्रवाह माप प्रारूपों (जैसे, एक्सएफ ई 96, या xfp) के लिए, नीचे सभी संस्करणों को उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए।
परख माध्यम की बफरिंग बिजली नपे-तुले पीएच जांच का उपयोग कर सकते हैं या तो सीधे बाह्य प्रवाह मंच में या अलग से एक मानक वक्र के निर्माण से मापा जा सकता है। इधर, बाह्य प्रवाह परख माध्यम से बफरिंग को मापने के लिए तीन विकल्प सभी injecti का उपयोग सहित, दिया जाता हैसेल मुक्त नमूना कुओं, या सेल युक्त कुओं (खंड 1) में या एक बाहरी पीएच माप (खंड 2) का उपयोग करके केवल पिछले इंजेक्शन बंदरगाह का उपयोग कर के साथ बाह्य प्रवाह विश्लेषक के बंदरगाहों पर। उदाहरण डेटा की पूर्ण गणना के लिए संलग्न स्प्रेडशीट देखें।
बाह्य प्रवाह साधन का पीएच का पता लगाने की क्षमता का उपयोग कर बफरिंग शक्ति को मापने के लिए, यह संकेत भिन्नता को कम करने के लिए सेल मुक्त कुओं का उपयोग करने के लिए सबसे सुरक्षित है। हालांकि, त्रुटि के भीतर, कोई अंतर सांख्यिकीय सेल मुक्त और सेल युक्त इस माप जब प्रदर्शन कुओं (डेटा दिखाया गया है) के बीच मौजूद है। नोट: 1.7 कदम में वर्णित भिन्नता noisier संकेत के नुकसान के साथ कहा, यौगिकों से या कोशिकाओं की उपस्थिति द्वारा प्रदत्त बफरिंग के लिए किसी भी संभावित परिवर्तनों के लिए लेखांकन का लाभ दिया जाता है। जैसा कि ऊपर कहा, हालांकि, कोई महत्वपूर्ण मतभेद तालिका 1 में दिखाया सेल मुक्त डिजाइन के बीच गणना की बफरिंग सत्ता में पाए गए औरयहाँ वर्णित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत तालिका 2 में बाद प्रयोग डिजाइन।
इसके अतिरिक्त, छोटे ΔpH पर्वतमाला (<0.4 इकाइयों; प्रयोगात्मक सबसे अच्छा 0.2 इकाइयों के लिए प्रतिबंधित) से अधिक है, रैखिक ढलान Δ मील प्रति घंटे / pmol एच साजिश रचने के द्वारा प्राप्त + पर्याप्त रूप से ΔpH और [एच +] के बीच लघुगणक संबंध अनुमान लगाती है। इस मानक वक्र के ढलान इसलिए 7 μl में पीएच / nmol एच + में परीक्षण के अंतर्गत परख माध्यम की बफरिंग शक्ति का प्रतिनिधित्व करता है, या मील प्रति घंटे / pmol एच + 7 μl में। हम मध्यम बफरिंग शक्ति बढ़ रही है या माप के समय के दौरान एक 0.2 पीएच इकाई परिवर्तन से अधिक है कि नमूने के लिए सेल घनत्व को कम करने की सिफारिश। माप समय भी कम किया जा सकता है, लेकिन यह स्थिर राज्य अम्लीकरण दर कम है और दर गणना में त्रुटि पेश हो सकता है।
कोशिकी अम्लीकरण सेलुलर चयापचय दर का आसानी से मापा संकेत है। (लैक्टेट उत्पादन द्वारा परिभाषित के रूप में) इसे ठीक तरह से परख माध्यम की बफरिंग शक्ति का पता करने के लिए महत्वपूर्ण है सेलुलर ग्लायकोलायसिस की दर निर्धारित करने के लिए, और उत्पादन की दर प्रोटॉन के लिए ऑक्सीजन की खपत और अम्लीकरण के बाह्य प्रवाह माप बदलने के लिए। इस गणना के प्रदर्शन करके, साइट्रिक एसिड चक्र में जारी सीओ 2 से उत्पन्न अम्लीकरण लैक्टेट उत्पादन का परिणाम है कि अम्लीकरण छोड़ने घटाया जा सकता है।
इस सुधार के लिए बफरिंग शक्ति को मापने के लिए यहां दिए गए कई अलग अलग तरीकों से अलग फायदे और नुकसान ले। एक पीएच जांच का उपयोग बाहरी माप बेहद सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, लेकिन परख थाली, परख के दौरान यौगिकों के अलावा, या टी की उपस्थिति के भीतर निहित fluorophores द्वारा शुरू की पीएच का पता लगाने में छोटे मतभेदों प्रतिबिंबित नहीं कर सकतेवह कोशिकाओं को खुद। में प्लेट पीएच माप इन मुद्दों का समाधान, लेकिन यह भी प्रयोगात्मक शोर की डिग्री बदलती परिचय।
ECAR करने के लिए सीओ 2 सुधार पहली बार ग्लाइकोलाइटिक दर की स्पष्ट और मात्रात्मक गणना के लिए अनुमति देता है, और एक प्रयोग के दौरान कुल ECAR को श्वसन और ग्लाइकोलाइटिक योगदान में भिन्नता का पता चलता है। 5 समीकरण और ओसीआर, ECAR के माप का उपयोग करना, और बिजली की बफरिंग, ग्लाइकोलाइटिक दर प्रदान की साधारण स्प्रेडशीट (तालिका 6) का उपयोग कर की गणना की जा सकती है। 6 यदि चाहें तो इस दर के बाद तदर्थ लैक्टेट माप द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। पेन्टोज़ फॉस्फेट मार्ग अत्यधिक सक्रिय है जहां कोशिकाओं में, इस तरह 6-aminonicotinamide रूप मार्ग अवरोधकों का उपयोग ग्लाइकोलाइटिक दर को अलग-थलग करने के लिए उपयोगी हो सकता है। दोनों सीओ 2 के योगदान की गणना – कुल से और लैक्टेट व्युत्पन्न एच + अतिरिक्त सेलुलर अम्लीकरण दर और आक्सीजन consumpt मापाआयन दर चयापचय गतिविधि के बारे में शक्तिशाली और मात्रात्मक बयान देने के लिए बाह्य प्रवाह डेटा का उपयोग कर के लिए एक अमूल्य उपकरण है।
बफरिंग शक्ति को मापने के लिए, और जांच और इच्छित डेटा के तहत कोशिकाओं के लिए बाह्य प्रवाह प्रयोग के अनुकूलन के लिए विभिन्न संशोधनों सहित यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं, का उपयोग करना, बरकरार कोशिकाओं में ग्लायकोलायसिस की दर प्रयोगात्मक स्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के तहत मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इस विधि को एक polystyrene सतह (का पालन किया जा सकता है कि या कोशिकाओं या अंगों) पर पक्षपाती संस्कृति में विकसित कर सकते हैं कि कोशिकाओं तक सीमित है। संवर्धित कोशिकाओं समरूप और मिला हुआ है जब उपयोगी डेटा अभी भी इन शर्तों में से एक सीमा से अधिक प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि यह सबसे अधिक विश्वसनीय है। गणना कश्मीर कोशिकाओं रहे हैं तो अलग substrates और आंशिक ऑक्सीकरण 6 के लिए अधिक से भरा ऑक्सीकरण के लिए 0.65-1.0 अधिकतम एच + / ओ 2 पर्वतमाला, कोशिकाओं के चयापचय के कुछ ज्ञान की आवश्यकता होती हैNown ग्लूकोज oxidize के लिए, 1.0 का एक मूल्य माना जा सकता है।
प्रणालियों में इस्तेमाल किया जब सभी चयापचय लक्षण वर्णन के लिए प्रासंगिक है, इस विधि विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जिसमें सांस की और ग्लाइकोलाइटिक चयापचय के बीच एक पारी सेलुलर एटीपी आपूर्ति स्टेम कोशिकाओं और ट्यूमर व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं के लक्षण वर्णन सहित एक महत्वपूर्ण फेनोटाइप है बनाए रखने के लिए। इन और अन्य संदर्भों में चयापचय नियंत्रण परिवर्तन को समझना इन प्रकार की कोशिकाओं की प्रयोगात्मक डिजाइन और विश्लेषण में मिलावट और सटीकता का एक बड़ा डिग्री की अनुमति देगा।
The authors have nothing to disclose.
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
LDH | Sigma | L1254 | chemical |