Method Article

温敏纳米结构表面的组织工程准备

DOI:

10.3791/53465

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March 1st, 2016

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1Department of Physics, Tokyo University of Science, 2Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women's Medical University

In This Article

Summary

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由热响应嵌段共聚物组成的纳米级海岛表面通过 Langmuir-Schaefer 方法制造，用于控制自发细胞粘附和分离。表面的制备以及细胞在表面上的粘附和分离都被可视化。

Abstract

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用于控制细胞粘附和分离的热响应性聚（N-异丙烯酰胺）（PIPAAm）固定化表面采用 Langmuir-Schaefer 方法制造。由聚苯乙烯和 PIPAAm （St-IPAAms） 组成的两亲性嵌段共聚物是通过可逆加成-碎裂链转移 （RAFT） 自由基聚合合成的。将 St-IPAAm 分子的氯仿溶液轻轻滴入 Langmuir 槽式装置中，水平移动装置的两个屏障以压缩薄膜以调节其密度。然后，通过表面固定装置将 St-IPAAm Langmuir 薄膜水平转移到疏水改性玻璃基板上。原子力显微镜图像清楚地揭示了表面的纳米级海岛结构。在 PIPAAm 分子的较低临界溶液温度范围内，细胞粘附和分离的强度、速率和质量受温度变化的调节。此外，在优化后的表面上成功恢复了二维细胞结构（细胞片）。这些独特的 PIPAAm 表面可能有助于控制细胞粘附和分离的强度。

Introduction

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纳米结构表面最近吸引了大量关注，因为它们的各种潜在应用，包括图案化，细胞培养，清洗，和表面交换。例如，通过荷叶和其它响应表面的纳米结构启发超疏水表面是能够反应以外部刺激1-4。

朗缪尔膜是最广泛研究的聚合物涂层中的一个。朗缪尔膜通过滴两性分子到空气-水界面5-8形成。该膜然后可通过物理或化学吸附被转移到一个固体表面上，并且可以使用垂直和水平转移方法9-12被控制在固体表面上的分子的构象。朗缪尔膜的密度可以通过压缩的空气 - 水界面精确地调节。最近，这种方法也被证明有效的用于制造纳米尺度的海岛structur利用两亲性嵌段共聚物上课。纳米结构被假定为是由疏水性链段的芯和亲水性链段13-17的壳的。此外，在表面上的纳米结构的数量是通过控制在界面上的嵌段共聚物的每个分子的面积（A M）调节。

我们专注于一个原始，独特的无支架组织工程方法，细胞片工程，使用温度响应培养表面。所开发的技术已经应用到再生疗法为各种器官18。温度响应培养表面是由接枝聚（N- -isopropylacrylamide）（PIPAAm），温度响应分子到表面19-27制成。 PIPAAm及其共聚物表现出的低临界溶液温度（LCST）在水性介质中在接近32℃的温度。培养表面还表现出一个温度响应....

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Protocol

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1.聚苯乙烯块聚（N -isopropylacrylamide）通过两步可逆加成断裂链转移（RAFT）自由基聚合合成

  1. 溶解苯乙烯（153.6毫摩尔），4-氰基-4-（ethylsulfanylthiocarbonyl）sulfanylpentanoic酸（ECT; 0.2毫摩尔）和4,4'-偶氮二（4-氰基戊酸）（ACVA; 0.04毫摩尔）在40ml 1， 4-二恶烷。冻结真空下在液氮中的溶液15-20分钟以除去反应性物质，并逐步在RT解冻。确保该解决方案完全解冻并重复这一冷冻泵解冻循环脱气三次。
  2. 得到的聚苯乙烯（PST）（分子量:13500），通过聚合一大分子RAFT试剂在70℃的油浴中15小时。
  3. 沉淀聚苯乙烯大分子RAFT试剂用800毫升乙醚，并在真空干燥。
  4. 溶解在4ml的1,4-二恶烷的IPAAm单体（4.32毫摩尔），聚苯乙烯大分子RAFT试剂（0.022毫摩尔），和ACVA（0.004毫摩尔）。
  5. 去掉如在步骤1.1中提到在由冷冻 - 抽吸 - 解冻脱气循环溶液中的氧气。
  6. 在70℃下进行聚合为在脱气处理后的油浴15小时。获得合成的St-IPAAm分子（MW:32800）中相同的方式作为聚苯乙烯大分子RAFT试剂。

2.硅烷化修饰的疏水玻璃基板的制备

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    Results

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    聚苯乙烯和聚（N- -isopropylacrylamide）（圣IPAAms）具有特定分子量的构成的嵌段共聚物通过RAFT自由基聚合来合成。 ECT被作为Moad 等人 28所述制备作为链转移剂。不同PIPAAm链长的二圣IPAAm分子合成，并且所得到的嵌段聚合物进行表征通过1 H核磁共振（NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）。圣IPAAms的分子量分别为32800和67900，具有窄分子量分布（1.31和1.50）。聚苯乙烯大分子RAFT试剂和PIPAAm的单体转化率被发现是17.4％和85.0％以上。合成的圣IPAAms被命名为圣IPAAm170和圣IPAAm480分别。

    每个分子不同区域（A M），朗缪尔电影以是捏造滴加溶解在氯仿溶液（ 图1A）的St-IPAAm分子空气-水界面。滴加圣IPAAm分子之后，空气-水.......

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    Discussion

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    温度响应性表面由朗缪尔 - 谢弗方法制造，并为细胞粘附/拆卸和细胞片恢复表面性能进行了优化。当使用表面的制造这种方法，几个步骤是关键的。圣-IPAAm分子的分子的组合物具有在表面结构和有很大影响的表面的稳定性，并且通过扩展，对细胞粘附和脱离。特别是，圣IPAAm分子应具有窄的分子量分布。在我们的方法中，两次与不同PIPAAm链长的St-IPAAm分子通过RAFT聚合合成，使分子量和分子量分布的控制。

    应采取措施，以防止空气 - 水界面的污染的圣IPAAm表面的制备过程中，以避免在纳米结构的缺陷。下探聚合物分子到界面上，contaminan之前TS应该吸气，直到表面压力达到约0达因/厘米。污染往往积累围绕槽和威廉米悬片的边缘。因为威廉米悬板具有在其表面上的一些污染，它被退火。当使用纸的Wilhelmy板，在界面处的抽吸步骤应至少重复两次。该πA M等温线也取决于污染的在空气-水界面的存在。我们建议的等温线的曲线膜的制造之前得到一次以上。因为疏水性修饰的玻璃基板的污染，也可能发生，衬底应与新鲜空气或氮气吹入以去除污染。

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    Disclosures

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    所有作者都为手稿的撰写做出了平等的贡献，并批准了最终版本。提交人声明，他们没有竞争的经济利益。

    Acknowledgements

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    这项研究得到了日本文部科学省 （MEXT） 创建高级跨学科研究创新中心计划创新系统开发项目"细胞片状组织工程中心 （CSTEC）"的财政支持。

    ....

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    N-异丙基丙烯酸Kohjin无目录号
    ：偶氮（4-氰氰酸）Wako Pure Chemicals016-19332
    乙烯Sigma-AldrichS4972
    1,3,5-三恶烷Sigma-AldrichT81108
    1,4-二恶烷Wako Pure Chemicals045-24491
    DMEMSigma D6429
    PBSNakarai11482-15
    链霉素GIBCO BRL15140-163
    青霉素GIBCO BRL15140-122
    胰蛋白酶-EDTASigmaT4174
    FBS日本生物血清JBS-11501
    BAECs健康科学研究资源库JCRB0099
    盖玻片松波玻璃工业C024501
    AFM NanoScope VVeeco
    1H NMR INOVA 400瓦里安，帕洛阿尔托
    ATR/FT-IR NICOLET 6700Thermo Scientific
    GPC HLC-8320GPCTosoh
    TSKgel Super AW2500， AW3000， AW4000Tosoh
    Langmuir-Blodgett 沉积槽 KSV InstrumentsKN 2002KSV NIWA Midium trough
    尼康 ECLIPSE TE2000-U尼康
    苯

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
    2. Fu, Q., et al.

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    Thermoresponsive SurfacesLangmuir Schaefer MethodCell Adhesion ControlCell Detachment ControlCell Sheet RecoveryAtomic Force MicroscopyNanostructured SurfacesPolymer SynthesisTemperature Responsive MaterialsTissue Engineering

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