En snabb Lufttorka släppa Kromosomberedning som lämpar sig för FISH i växter
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
Framställning av kromosom sprider är en förutsättning för ett framgångsrikt utförande av fluorescens in situ hybridisering (FISH). Framställning av högkvalitativa växtkromosom sprider är utmanande på grund av den styva cellväggen. En av de godkända förfaranden för framställning av växtkromosomer är en s.k. dropp-preparat, även känd som drop-spridning eller lufttorkningsteknik. Här presenterar vi ett protokoll för snabb beredning av mitotisk kromosom sprider lämplig för FISH detektion av enstaka och höga kopia DNA-sonder. Denna metod är en förbättrad variant av det lufttorra droppmetoden utförs under en relativ fuktighet av 50% -55%. Detta protokoll består av ett minskat antal tvättsteg gör sin ansökan enkelt, effektivt och reproducerbar. Uppenbara fördelarna med denna metod är väl spridda, oskadade och många metafaskromosomer tjänar som en perfekt förutsättning för en framgångsrik FISH-analys. Med hjälp av detta protokoll vi fått hög kvalitet kromosome spreadar och reproducerbara FISH resultat Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum och Secale cereale.
Introduction
Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) är ett effektivt verktyg för fysikalisk kartläggning av enkel-och höga kopieringssekvenser på kromosomnivå. Förutsättning är framställningen av högkvalitativa kromosomspridningar. Det finns ingen allmän kromosom förberedelse protokoll som skulle vara lika bra för djur- och växtceller. Beredning av växt kromosomer är särskilt utmanande på grund av den stela cellväggen och olika cytoplasma enhetlighet inom olika arter. En av de gynnsamma förfaranden för framställning av växtkromosomer är en så kallad dropptekniken även känd som drop-spridningsteknik och lufttorkningsteknik 1,2. Denna metod introducerades för första gången 1958 av Rothfels och Siminovitch för in vitro odlade däggdjursceller 3. Senare Martin et al. 4 och et al. Kato 5 anpassat denna metod för växter.
Mer nyligen, en metod som heter "SteamDrop &# 39; utvecklades som använde vattenånga för framställning av icke-överlappande kromosomer 6. Även var den positiva inverkan av hög fuktighet observerats tidigare 7, "SteamDrop" levererar en kontrollerad arbetsflöde högkvalitativa kromosompreparat 6. Ångbehandlingen orsakar sträckning av kromosomer sannolikt kopplade till vissa ändringar av kromosomala proteiner. Kvaliteten på erhållna metafas sprider är mycket hög, även om kvarhållande av ett tillräckligt antal av kompletta metaspreadarna för efterföljande FISH experiment kräver teknisk expertis.
Här presenterar vi ett protokoll för framställning av mitotiska spannmåls kromosomer som lämpar sig för FISH detektion av enstaka och hög kopia sonder 5,8. Denna metod är en förbättrad variant av det lufttorra dropp metod som beskrivits av Kato 9 utförs under relativ fuktighet av 50% -55% (figur 1). Detta protokoll består av ett minskat antaltvättsteg gör sin ansökan enkelt, effektivt och reproducerbar. Med hjälp av detta protokoll vi fått högkvalitativa kromosom uppslag och FISH resultat för Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum och Secale cereale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kromosom förberedelse experiment har utförts med hjälp av unga rötter spannmål som hör till gräsfamiljen (Poaceae). Alla analyserade arter har 14 relativt lång mitotiska metafaskromosomer (11-15 pm) i diploida genomet set och tillhör stora genomet arter (5,1-7,9 GBP).
Längd grodda rötter var inte mer än 2 cm för att erhålla maximalt meristemvävnad. Synkronisering av delande celler uppnåddes genom en 20 timmar lång isvatten behandling som förbättrat mängden mitotiska meta …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy ‘SteamDrop’ method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
