A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Preparazione degli spread dei cromosomi è un prerequisito per la performance di successo di ibridazione in situ fluorescente (FISH). Preparazione di alta qualità spread pianta cromosomiche è difficile a causa della parete cellulare rigida. Uno dei metodi approvati per la preparazione di cromosomi pianta è una cosiddetta preparazione goccia, noto anche come ripartizione goccia o tecnica aria di essiccazione. Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione rapida del cromosoma mitotica diffonde adatto al rilevamento di FISH sonde singole e alte DNA copia. Questo metodo è una migliore variante del metodo goccia aria secca eseguita sotto un'umidità relativa del 50% -55%. Questo protocollo comprende un numero ridotto di fasi di lavaggio rendendo l'applicazione facile, efficiente e riproducibile. Evidenti vantaggi di questo approccio sono ben distribuite, non danneggiati e numerosi cromosomi in metafase che servono come presupposto ideale per l'analisi FISH successo. Usando questo protocollo abbiamo ottenuto cromato di alta qualitàosome spread e risultati FISH riproducibili per Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.
Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è uno strumento efficace per la mappatura fisica delle sequenze singole e alta copia a livello cromosomico. Il presupposto è la preparazione degli spread cromosomiche di alta qualità. Non c'è cromosoma protocollo preparazione generale che sarebbe ugualmente adatto per cellule animali e vegetali. Preparazione dei cromosomi vegetali è particolarmente difficile a causa della parete cellulare rigida e vari coerenza citoplasma in specie diverse. Uno dei metodi favorevoli per la preparazione di cromosomi pianta è una tecnica cosiddetta goccia anche noto come tecnica di diffusione drop e asciugatura all'aria tecnica 1,2. Questo metodo è stato introdotto nel 1958 da Rothfels e Siminovitch per in vitro cellule di mammifero coltivate 3. Successivamente Martin et al. 4 e Kato et al. 5 adattato questo metodo per le piante.
Più di recente, un metodo denominato 'SteamDrop &# 39; stato sviluppato che utilizzava vapore acqueo per la preparazione di cromosomi non sovrapposti 6. Anche se, l'influenza positiva di elevata umidità è stato osservato in precedenza 7, 'SteamDrop' offre un flusso di lavoro controllata di preparati cromosomici di alta qualità 6. Il trattamento a vapore provoca stiramento dei cromosomi, probabilmente legati ad alcune modifiche di proteine cromosomiche. La qualità del risultato spread metafase è molto alta, anche se di contenimento del numero sufficiente di completo metafase si diffonde per le successive esperimenti di FISH richiede competenze tecniche.
Qui vi presentiamo un protocollo per la preparazione di cromosomi mitotici di cereali adatti per la rilevazione FISH di singoli e di alta copia sonde 5,8. Questo metodo è una migliore variante del metodo caduta asciugare descritto da Kato 9 eseguita sotto umidità relativa del 50% -55% (Figura 1). Questo protocollo comprende un numero ridottodi fasi di lavaggio rendendo l'applicazione facile, efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo abbiamo ottenuto spread cromosomiche di alta qualità e risultati FISH per Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.
L'esperimento preparazione cromosoma è stata effettuata utilizzando radici giovani di cereali appartenenti alla famiglia delle graminacee (Poaceae). Tutte le specie analizzate hanno 14 cromosomi in metafase relativamente lunga mitotico (11-15 micron) nel set genoma diploide e appartengono a specie di grande genoma (5,1-7,9 GBP).
Lunghezza di radici germinati non era più di 2 cm per ottenere un massimo di tessuti meristematici. Sincronizzazione di divisione delle cellule è stato raggiu…
The authors have nothing to disclose.
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
Pectolyase | Sigma | P3026 | |
Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |