Stamcellelignende<em> Xenopus</em> Embryonale eksplantater å studere Tidlig Neural utviklingstrekk<em> In Vitro</em> Og<em> I Vivo</em

Summary

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Abstract

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Introduction

Virveldyr nervesystemet kommer fra det nevrale plate som et homogent lag av neuroepithelial celler. Forstå hvordan utviklingsprogrammene blir indusert, kodet, og etablert under regionalisering av nevrale plate er i dag, et hovedmål i utviklingsbiologi. Sammenlignet med andre systemer, er eksperimentelt mottagelig Xenopus embryo en modell av valget for å analysere tidlige trinn av nevral utvikling ^1,2. Det er lett å få tak stort antall av embryoer, og ekstern utvikling gir tilgang til de aller første trinnene i neurulation ^tre. Mange verktøy er tilgjengelige for eksperimentelt manipulere Xenopus laevis (X. laevis) embryonal utvikling. Mikro-injeksjon av mRNA eller morpholinos (MO), inkludert induserbare Mos, sammen med biokjemiske og farmakologiske verktøy, tillater kontrollert gevinst på funksjon (GOF) og tap av funksjon (LOF) og spesifikk endring av signalveier ^4,5. The blastocoel tak ektoderm, plassert rundt dyret pol av en blastula, eller et meget tidlig gastrula embryo, og refereres til som "Animal Cap '(AC), er en kilde til pluripotente celler som kan programmeres ved manipulering av genekspresjon før eksplantater forberedelse. I dette manuskriptet er detaljerte protokoller å bruke X. laevis AC explants å teste in vitro og in vivo molekylære mekanismer og cellulære prosesser underliggende nevrale utvikling.

En teknikk er presentert, slik fin observasjon av genutrykksmønster i en Xenopus rumpetroll nevralrøret, et tidlig trinn i identifiseringen av skjebnen besluttsomhet signaler. Mens observasjon av flatmontert vev er ofte brukt i studiet av kyllingfoster ^6, det har ikke vært riktig beskrevet i Xenopus. Manipulering av genuttrykk ved å injisere syntetisk mRNA eller MO inn i blastomeres av 2 eller 4 celle scene embryoer tillater programmering av ACeksplantater ^4. For eksempel hemming av Bone Morfogenetisk protein (BMP) veien ved ekspresjon av anti-BMP faktor Noggin, gir et nevralt identitet til ^AC-3 celler. Protokollen er beskrevet for å utføre lokal og tidsstyrt eksponering av AC-eksplantater til ytre signaler via direkte kontakt med en anionbytterharpiks vulst. Endelig en teknikk er beskrevet for testing utviklingstrekk av nevrale stamceller in vivo ved transplantasjon av blandede eksplantater preparert fra forskjellige programmerte celler dissosierte og re-forbundet.

Frosken embryo er en kraftig modell for å studere tidlig virveldyr neural utvikling. Kombinere manipulering av genuttrykk eksplanterer in vitro kulturer gir viktig informasjon i studiet av neuroepithelium regionalisering, spredning, og morphogenesis ^7-12. Programmeringen av AC eksplantater tillatt utvikling av en funksjonell hjerte ex vivo ^13,14. Brukenav eksplantat pode ¹⁵ førte til identifisering av den minimale induserende transkripsjonen bryteren neural crest differensieringsprogram ^16. Zona limitans intrathalamica (ZLI) er et signal senter som utskiller Sonic pinnsvin (Shh) for å kontrollere veksten og regionalisering av halebrain. Når kontinuerlig utsatt for Shh, neuroepithelial celler coexpressing de tre transkripsjonsfaktorer gener – barH lignende homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) og Iroquois-3 (irx3) – erverve to kjennetegn ved ZLI rommet: kompetanse til å uttrykke shh, og evnen til å skille fra fremre plate nevrale celler. Som modellsystem, vil induksjon av en ZLI skjebne i neuroepithelial celler bli presentert ^åtte.

Disse protokollene tar sikte på å gi enkle, billige og effektive verktøy for utviklings biologer og andre forskere til å utforske grunnleggende mechanisms av viktige nervecelle atferd. Disse protokollene er svært allsidig og la etterforskningen av et stort spekter av ytre og indre nevrale bestemmelses signaler. Det tillater langsiktig in vivo analyse av nevrale avstamning engasjement, induktive interaksjoner og celle atferd.

Protocol

Eksperimenter i samsvar med nasjonale og europeiske regler om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål og med internasjonalt etablerte prinsipper for erstatning, reduksjon og raffinement. 1. Flat-montering av Xenopus laevis Tadpoles Anterior nevralrøret Etter Whole-mount In Situ Hybridisering Skaff X. laevis embryoer i henhold til standardprosedyrer 4 og alder dem før de når neurula scenen 26 år og eldre (i henhold til Nieu…

Representative Results

På grunnlag av morfologiske faktorer i forskjellige arter, embryologiske manipulasjoner, og uttrykket mønster av regulatoriske gener, har en begrepsmodell som neural platen er oppdelt i tverrgående og langsgående segmenter som definerer en utviklingsmessig gittergenererende forskjellige histogenic felt. I nevrale plate, er det primordia av forhjernen, midthjernen, hindbrain og ryggmarg alle allerede etablert langs antero-posterior (AP) akse under gastrulation (anmeldt i 23-25).<…

Discussion

Neural utvikling er orkestrert av et komplekst samspill mellom cellulære utviklingsprogrammene og signaler fra de omkringliggende vev (Anmeldt i ^3,31,32). Her beskriver vi et sett med protokoller som kan brukes i X. laevis embryoer for å utforske ytre og indre faktorer som er involvert i nerve skjebne bestemmelse og neural morphogenesis in vitro og in vivo. Disse protokoller kan anvendes som sådan på X. Tropic embryoer, men X. Tropic embryoer er fire ganger min…

Materials

Paraformaldehyde	VWR	20909.290	Toxic
anion exchange resin beads	Biorad	140- 1231
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A-7888	For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine	GIBCO	15751-045	antibiotic
Bovine Serum Albumin	SIGMA	A7906	for bead preparation