Isolering av specifika genomregioner och Identifiering av associerade molekyler av enChIP

Summary

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Abstract

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

Introduction

Identifieringen av molekyler som är förknippade med specifika genomiska regioner av intresse är skyldig att förstå mekanismerna för reglering av genomiska funktioner som transkription och epigenetisk reglering. Även om flera tekniker har utvecklats för biokemisk analys av specifika genomregioner ^1-7, är de inte används i stor utsträckning i detta skede på grund av sina inneboende problem, såsom begränsad tillämpning (t.ex. endast för hög kopietal loci eller loci med upprepningar) och för mycket tid och ansträngningar krävs.

För att kunna utföra biokemisk analys av specifika genomregioner lätt, har vi utvecklat två locus-specifika kromatin immunoprecipitation (chip) teknik, nämligen inser ChIP (Ichip) ^13/08 och konstruerade DNA-bindande molekyl-medierad ChIP (enChIP) ^14-17 . I Ichip, är ett ställe av intresse taggade uttryck genom att placera igenkänningssekvenser av en exogen DNA-bindande proteinet, såsom LexA. lokus isoleras därefter genom affinitetsrening med användning av den märkta DNA-bindande proteinet. I enChIP, manipulerade DNA-bindande molekyler, såsom zink-fingerproteiner, transkriptionsaktivator liknande (TAL) proteiner, och klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) komplex, används för att märka en plats av intresse (Figur 1). Därefter genomregion isolerades genom affinitetsrening av de märkta DNA-bindande molekyler.

En av fördelarna med enChIP över Ichip är att införande av igenkänningssekvenser av en exogen DNA-bindande proteinet är inte nödvändigt. Målinriktningen av loci med användning crispr komplex bestående av en katalytiskt inaktiv form av Cas9 (dCas9) och en guide-RNA (gRNA) är mycket enklare än målsökning av dessa regioner av Ichip eller enChIP använder TAL och zink-fingerproteiner. Här beskriver vi en steg-för-steg-protokoll för enChIP kombinerat med masspektrometri och RNA-sekvensering (RNA-SEQ) för att identifiera locus-Associated proteiner och RNA, respektive.

Protocol

1. Design av Engineered DNA-bindande molekyler erkänner mållokuset För enChIP använder crispr komplex, använder CRISPRdirect webbverktyget (http://crispr.dbcls.jp) för att identifiera kandidat gRNA målsekvenser i den genomiska regionen av intresse som beskrivs som tidigare 18. Detta webbverktyg returnerar 23 bp genomiska platser i formen 5'-N 20 NGG-3 "i målområdet. Syntetisera en gBlock inklusive U6 promotorsekvensen och sekvensen för 5'-N 20 i 5'-N 20 NGG-3 'med användning av kommersiella tjänster (se figur 2) 19,20. För subkloning ändamål innehålla lämpliga restriktionsenzymställen utanför gBlock. För in gBlock i en lämplig vektor som tidigare beskrivits 16. Flera retrovirusvektorer för gBlocks finns (se Material). För enChIP använder TAL proteiner, designa TAL proteiner som känner igen target loci. Generera plasmider som kodar för TAL proteiner med användning av kommersiella tjänster. Generera expressionsvektorer innehållande de TAL proteiner fuserade med en eller flera taggar såsom 3 × FLAG som tidigare beskrivits 15. 2. Upprättande av celler för enChIP Analysis Uttryck 3 × FLAG-dCas9 och gRNA (crispr baserade förfarandet) eller 3 × FLAG-TAL (TAL proteinbaserad procedur) i de celler som skall analyseras som beskrivits tidigare 14-17. Använd transient transfektion om transfektionseffektiviteten är hög. En expressionsvektor innehållande 3 × FLAG-dCas9 och CMV-promotorn är tillgänglig (se Material). Överväga att införa stabila trans med konventionella metoder om transient transfektion effektivitet är låg. Förutom de tidigare nämnda retrovirala vektorerna för gBlock, retrovirala vektorer 3 × FLAG-dCas9 är tillgängliga (se Material). <li> Bekräfta expression av 3xFLAG-dCas9 eller 3xFLAG-TAL-proteinet i de transfekterade cellerna genom immunoblotanalys med användning av en anti-FLAG-antikropp (Ab) såsom beskrivits tidigare 14-17. Obs: Uttryckning av dessa märkta proteiner kan även bekräftas genom intracellulär färgning med anti-FLAG-FITC och en efterföljande FACS-analys. Ett protokoll för intracellulär färgning kan laddas ner från vår hemsida (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html). Bekräfta uttryck av gRNA av standard RT-PCR-teknik. För kvantitativ identifiering av proteiner som interagerar med den genomiska regionen av intresse, överväga användning av en stabil isotop märkning av aminosyror i cellkultur (SILAC) analys i kombination med enChIP (enChIP-SILAC). Obs: Media för SILAC analysen kan köpas från kommersiella leverantörer. SILAC är kraftfull i att upptäcka specifika interaktioner. Kulturceller i SILAC tung medium. Förbered celler Culturött i SILAC ljus mediet som en negativ kontroll. Använd minst 5 x 10 7 celler för varje SILAC medium (tung eller lätt). För effektiv märkning, lägga både L-lysin-2HCl, 13 C 6 och L-arginin-HCl, 13 C 6, 15 N 4 i SILAC Tunga media. Obs: Minst fem celldelningar är nödvändiga för att märka proteiner. Exempelvis kultur humana fibrosarkom HT1080 celler som stabilt uttrycker 3xFLAG-dCas9 och en gRNA vid 37 ° C och 5% CO2 i DMEM-medium för SILAC och dialyserat fetalt bovint serum med Lysin-2HCl plus L-arginin-HCl (tända medium) eller 13 C 6 L-lysin-2HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-arginin-HCI (Heavy medium) (se Material) 16. Tillsätt 50 mg av lätt eller tung L-lysin-2HCl och L-arginin-HCl i 500 ml medium. Trypsinize och förnyad utbredning celler innan de blir sammanflytande, så att celler upprätthålla exponentiell growttim. 3. Tvärbindning av celler med formaldehyd För celler i suspensionskultur, överförings 2 x 10 7 celler som exprimerar 3xFLAG-TAL proteiner eller 3xFLAG-dCas9 plus gRNA och suspendera i 30 ml normalt odlingsmedium i en 50 ml centrifugrör. När flera celler används, öka volymerna och mängder av reagens proportionellt. För SILAC experiment, blanda cellerna odlats i tung medium eller ljus medel (5 x 10 7 celler vardera) och dividera summan av 1 x 10 8 celler i 5 rör innehållande 2 x 10 7 celler. Lägg 810 pl av 37% formaldehyd till 30 ml av cellsuspensionen (slutkoncentration 1%) och inkubera vid 37 ° C under 5 minuter. För anhängare celler, direkt fixa celler i odlingsskålar genom att tillsätta 810 pl av 37% formaldehyd till 30 ml odlingsmedium. Stoppa tvärbindning genom tillsats av 3,1 ml av 1,25 M glycin-lösning (slutlig koncentration 127 mM) ochinkubera vid RT i 10 min. Samla cellerna genom centrifugering (300 x g under 5 min vid 4 ° C). Försiktigt kassera supernatanten inklusive formaldehyd och förvara den i en lämplig avfallsflaskan. För vidhäftande celler, lösgöra celler med en cellskrapa och skörd i en 50 ml-rör, och samla upp celler, såsom beskrivs i det här steget. För SILAC experiment, blanda de lösgjorda celler odlade i tung medium eller ljus medel (5 x 10 7-cell vardera), dividera det totala av 1 x 10 8 celler i 5 rör innehållande 2 x 10 7 celler, och samla upp celler, såsom beskrivs i detta steg. Tvätta cellpelleten med 30 ml PBS två gånger per rör. Försiktigt kassera supernatanten inklusive formaldehyd och förvara den i en lämplig avfalls bottle.Handle formaldehyd avfall enligt kemikaliesäkerhetsanvisningar. De fixerade cellerna kan frysas och förvaras vid -80 ° C. 4. Framställning av Chromatin (per 2 x 107-celler) Suspendera de fixerade cellerna i 10 ml cell-lys-buffert (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, och 1 × proteasinhibitorer) och inkubera på is under 10 minuter. Centrifugera provet (830 x g vid 4 ° C under 8 min) och kassera supernatanten försiktigt. Suspendera pelleten i 10 ml av kärn lysbuffert (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxikolat, 0,5% lauroylsarkosin och 1x proteasinhibitorer). Inkubera på is under 10 min och vortexblanda varje 2-3 min. Centrifugera provet (830 × g vid 4 ° C under 8 min) och kassera supernatanten försiktigt. Tvätta pelleten i 10 ml PBS. Pelleten (kromatin fraktion) kan lagras vid -80 ° C efter omedelbar frysning i flytande kväve. 5. Sonication av Chromatin (per 2 x 10 7 celler) Suspendera kromatinet fraktionen i 800 | ilmodifierad lysbuffert 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdeoxikolat, 0,1% SDS, och 1x proteasinhibitorer) och överför till en 1,5 ml rör. Sonikera kromatin med hjälp av en sonikator (se Material) och följande villkor: output: 3; tull: 100% (kontinuerlig); och tid: fri. Utför 10-18 cykler av sonikering under 10 sek och kylning på is under 20 sek. För att undvika överhettning, inkubera proverna på is under 2 minuter var 5-6 cykler. För att undvika skumning, hålla positionen för spetsen av sonikering sonden 0,5 cm ovanför botten av röret. Centrifugera provet vid (16 tusen x g vid 4 ° C under 10 min) och överför supernatanten till ett 1,5 ml rör. Det sonikerade kromatin kan lagras vid -80 ° C efter omedelbar frysning i flytande kväve. 6. Utvärdering av Chromatin Fragmentation Blanda 10 pl av den fragmenterade kromatin med 85 il destillerat vatten. Tillsätt 4 | ilav 5 M NaCl och inkubera vid 65 ° CO / N. Tillsätt 1 pl av 10 mg / ml RNas A och inkubera vid 37 ° C under 45 minuter. Tillsätt 2 | il 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 | il 1 M Tris (pH 6,8), och 1 | il av 20 mg / ml proteinas K, och sedan inkubera vid 45 ° C under 1,5 h. Separata 10 pl av provet genom elektrofores i en 1% agarosgel som inte innehåller färgande färgämnen såsom SYBR Green. Fläck gelén för att utvärdera fördelningen av längderna av den splittrade kromatin. Förhållanden som genererar en medellängd på 0,5-2 kbp (intervallet 0,2-4 kbp) rekommenderas. Rena DNA från de återstående proven genom fenol-kloroform-extraktion eller genom att använda en DNA-extraktion-kit (se Material). Det renade DNA kan användas som underlag DNA för att uppskatta utbyten av enChIP analyser (se 8.11). 7. Framställning av Dynabeads konjugerad med antikroppar (per 2 x 10 7 celler) Prepare två 1,5 ml rör, ett för pre-clearing användning av normalt mus IgG och den andra för inkubation med anti-FLAG Ab. Tillsätt 150 pl av protein G-konjugerade magnetiska pärlor (se Material) till varje rör. Placera rören på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Kasta bort supernatanten genom pipettering. Suspendera pärlorna i 1 ml PBS innehållande 0,01% Tween-20 (PBS-T). Placera rören på ett magnetiskt ställ och vänta 2 min. Kassera supernatanten genom pipettering, och sedan upprepa steg. Suspendera pärlorna i 1 ml PBS-T innehållande 0,1% BSA. Tillsätt 15 mikrogram av normal mus-IgG eller anti-FLAG Ab och rotera vid 4 ° CO / N. Spinn ner en kort stund, sedan placera rören på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Kasta bort supernatanten genom pipettering. Suspendera pärlorna i 1 ml PBS-T. Vänd prov flera gånger och spinn ner en kort stund. Placera rören på en magnet stå och vänta på 3 minuter, därefter kassera supernatanten genom pipettering. Upprepa tvättaytterligare två gånger med PBS-T (totalt tre tvättsteg). 8. Kromatin Immunoprecipitation (per 2 x 10 7 celler) Blanda den splittrade kromatin framställd i 5,3) (approximativt 800 | il) med en femtedel av volymen (ca 200 | j, l) av modifierat lysbuffert 3 innehållande 5% Triton X-100 (slutkoncentration av 1% Triton X-100). Lägg kromatinet lösningen till röret, i vilken protein G-konjugerade magnetiska kulor konjugerade med normal mus-IgG framställdes. Rotera vid 4 ° C under 1 timme. Placera röret på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Överför supernatanten in i röret i vilket protein G-konjugerade magnetiska pärlor konjugerade med anti-FLAG-Ab framställdes. Rotera vid 4 ° CO / N. Placera röret på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Kasta bort supernatanten genom pipettering. Suspendera pärlorna i 1 ml av buffert med låg salthalt (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCI, 1% Tritons X-100, 0,1% SDS och 1 x proteasinhibitorer) och rotera vid 4 ° C under 5 minuter. Placera röret på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Kassera supernatanten genom pipettering och upprepa tvättsteget. Tvätta pärlorna med buffert med hög salthalt (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCI, 1% Triton X-100, 0,1% SDS och 1 x proteasinhibitorer) två gånger. Tvätta pärlorna med LiCl-buffert (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoxikolat, och 1x proteasinhibitorer) två gånger. Tvätta pärlorna med TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCI, 0,1% IGEPAL CA-630, och 1 x proteasinhibitorer) en gång. Suspendera pärlorna i 200 pl elueringsbuffert (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCI, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x proteasinhibitorer, och 500 | ig / ml 3 x FLAG-peptiden) och inkubera vid 37 ° C under 20 min. Placera röret på en magnet stå och vänta i 3 minuter. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör och upprepa elutjon steg. Rena DNA från liten del (t.ex. 5%) av eluatet genom fenol-kloroform-extraktion eller genom att använda en DNA-extraktion-kit (se Material). Det renade DNA: t kan användas för PCR med specifika primeruppsättningar att uppskatta utbytena av enChIP analyser genom att jämföra med input DNA framställt i Steg 6,7 såsom beskrivits tidigare 14,16. 9. SDS-PAGE, Färgning och Masspektrometrisk analys Blanda eluatet (400 pl) med en ml 2-propanol, 50 fil 3 M natriumacetat (pH 5,2), och 5 | il av 20 mg / ml glykogen. Fällning kromatinet vid -20 ° CO / N. Centrifugera provet (16000 x g vid 4 ° C under 30 min) och kassera supernatanten. Skölj pelleten med 1 ml 70% etanol och centrifugera igen (16 tusen x g vid 4 ° C under 10 min). Kassera supernatanten fullständigt genom pipettering. Suspendera pelleten i 40 pl 2x provbuffert (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% sackaros och 0,004% bromfenolblått). Vortexa i 5 min för att upplösa pelleten fullständigt, och sedan inkubera vid 100 ° C under 30 min för att denaturera proteinerna och backtvärbindningen. För SDS-PAGE, köra 40 | il av provet på gelén tills färgen når 1 cm under brunnen. Obs: Vi använder vanligtvis 4-20% gradientgeler, men andra% geler kan användas. Fläck gelén med Coomassie Brilliant Blue eller silverfärgning. Skär gelen i fem stycken (2 mm höjd). Utför i gel matsmältningen och masspektrometrisk analys som beskrivits tidigare 13-16. För SILAC experiment med 5 x 10 7 celler vardera (totalt 1 x 10 8 celler), suspendera pelleten från de första fem rören i 40 pl 2x provbuffert (det är inte nödvändigt att skala upp). 10. Rening av RNA och RNA-Seq analys För att rena RNA efter enChIP, tillsätt 5 U / ml RNas-inhibitor (see Material) och alla de buffertlösningar, förutom modifierat lysbuffert 3 och elueringsbufferten, till vilken tillsätt 40 U / ml av RNas-inhibitor. Blanda eluatet (400 pl) med 16 pl 5 M NaCl och inkubera vid 65 ° C under 2 h. Tillsätt 1 ml av syra-guanidin-fenol-reagens (se Material) till provet. Vortex under 15 sekunder och sedan inkubera vid rumstemperatur under 5-15 min. Centrifugera provet i 15 minuter vid 12.000 x g och RT. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml rör och tillsätt 5 pl av p-bromanisol. Vortexa i 15 sekunder och sedan inkubera vid RT i 3-5 min. Centrifugera provet för 10 min vid 12 tusen x g och RT. Överför supernatanten (ca 1 ml) in i ett nytt 2 ml-rör och tillsätt 1 ml 2-propanol. Vänd röret och inkubera vid RT i 10 min. Ladda blandningen på en kolonn i en RNA-reningskit (se Material). Centrifugera kolumnen för en min vid 12.000 x g och RT. Tvättakolonnen med 400 ul av RNA-tvättbuffert i en RNA-reningskit (se Material). Lägg 80 il DNas I cocktail (blandning av 5 il DNas I (1 U / ul), 8 pl 10 × DNas I Reaction Buffer, 3 il DNas / RNas-fritt vatten, och 64 pl RNA Wash Buffer i en RNA-reningskit (se Material)) till kolonnen. Inkubera provet vid 37 ° C under 15 minuter och centrifugera sedan i 30 sek vid 12 tusen x g och RT. Tvätta kolonnen med 400 ul av RNA-Förtvätt buffert i en RNA-reningskit (se Material) två gånger. Eluera RNA med 50 pl DNas / RNas-fritt vatten. Den eluerade RNA: t kan användas för RNA-sekvensering.

Representative Results

Sammantaget kan 1-30% av målgruppgenomregioner renas med hjälp av enChIP. Figur 3 innefattar representativa uppgifter som visar utbytena av enChIP analyser inriktning telomerer och promotorn av interferon (IFN) reglerande faktor-1 (IRF-1) genen. Som exempel på typiska resultat, Tabell 1 listar de proteiner associerade med IRF-1-promotorn i en IFNy specifikt sätt identifieras av enChIP-SILAC, Tabell 2 listar telomeren bindande proteinerna identifierade genom enChIP kombinerad med masspektrometri (enChIP-MS) och Tabell 3 visar RNA i samband med telomererna identifierats av enChIP-RNA-Seq. Figur 1. Översikt över enChIP. enChIP användning crispr (A, B) och TAL (C, D, E </strong>) visas. Ett lokus av intresse är märkt med konstruerade DNA-bindande molekyler, såsom en TAL proteinet eller crispr system bestående av en katalytiskt inaktiv form av Cas9 (dCas) guide RNA (gRNA). De molekylära interaktioner fixeras med formaldehyd eller andra tvärbindningsmedel, om nödvändigt. Därefter fixeras kromatin fragmenteras genom ultraljudsbehandling eller enzymatisk nedbrytning. De taggade genomregioner renas genom affinitetsrening. Slutligen tvärbindning omvända, och samverkande molekyler (genomiska regioner, RNA och proteiner) identifieras med hjälp av nästa generations sekvensering och masspektrometri. Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2. Sekvens av gBlock. Den U6 promotor (i svart), G nukleotid böre styrsekvensen (i blått), är styrsekvensen (gRNA spacer) (i rött), ställningen sekvensen (i grönt), och terminatorsekvensen (orange) visas. Figur 3. Utbyten av representativa enChIP analyser. (A) Andel ingångar för målet IRF-1 locus och icke-mål Sox2 locus. (B) Andel ingångar för målgrupp telomerer och utanför målgruppen y-satelliter. Siffrorna har anpassats och modifierats tidigare publikationer 15,16. Kategorier Proteiner Transkription DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homolog, PURβ, aktiverad RNA-polymeras II transkriptionsaktivator p15, BTF3, myb bindandeprotein 1A Histon deacetylering, corepressor komponenter RBBP4, PA2G4, TBL3 Acetyltransferas Protein arginin N-metyltransferas 1 DNA-topoisomeras DNA topoisomeras 2α Histoner Histon H2A.Z, histon H3.2 Tabell 1:. Exempel på proteiner som är förknippade med den humana IRF-1-promotorregionen i en IFNy specifikt sätt identifieras av enChIP-SILAC Tabellen har anpassats från en tidigare publikation 16. Kategorier Proteiner Däggdjurs telomeren-bindande proteiner PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 Telomer-biENDE proteiner i jäst eller andra organismer Imp4 Proteiner som interagerar med telomer-bindande proteiner [associerade telomer-bindande protein] DNA-polymeras α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FOXP2-POT1], exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] Proteiner lokalisera till heterokromatin BEND3 Proteiner som reglerar epigenetiska märken KDM5C Proteiner vars mutationer påverkar telomer-funktion DNA-polymeras α (POLA1), HAT1, Nup133, Cdk7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamat-cystein ligas, glutaredoxin, SMRC1 Tabell 2:. Exempel på proteiner som är förknippade med mus telomererna identifierade genom enChIP-MS Tabellen har varit ADAPTEd från en tidigare publikation 15. Kategorier RNA Telomeras komponenter TERC, Rmrp Telomera RNA Terras scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 H / ACA snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118 lncRNA Neat1 Tabell 3: Exempel på RNA i samband med mus telomererna identifierats av enChIP-RNA-Seq Tabellen har anpassats från en tidigare publikation 17..

Discussion

Here, we describe the purification of specific genomic regions using engineered DNA-binding molecules such as the CRISPR system and TAL proteins, and the identification of proteins and RNAs bound to these genomic regions. Binding of engineered DNA-binding molecules to the genome may affect chromatin structure, including nucleosome positioning, and may abrogate genomic functions, as described in CRISPR interference experiments²¹. To avoid these potential aberrant effects, we propose specific guidelines for choosing target genomic regions. First, to avoid potential inhibition of the recruitment of RNA polymerases and transcription factors, as well as disruption of nucleosome positioning around the transcription start site, the target regions for analyses of promoter regions should be several hundred base pairs upstream of (5′ to) the transcription start site. By contrast, when analyzing genomic regions with distinct boundaries, such as enhancers and silencers, genomic regions that are directly juxtaposed to these regions can be targeted because it is less likely that the binding of engineered DNA-binding molecules will affect their functions. Furthermore, it is best to avoid using target regions that are conserved among different species, because important DNA-binding molecules often bind to evolutionarily conserved regions and inhibition of their binding might disrupt the functions of the target genomic regions. In this regard, it is always necessary to check that the function of the target genomic region is maintained in the established cells used for enChIP analyses. Because multiple gRNAs can be tested easily and it is tedious and expensive to generate multiple versions of TAL or zinc-finger proteins recognizing different target genomic regions, enChIP using CRISPR is more advantageous than enChIP using other proteins.

It has been shown that dCas9 binds to off-target sites although affinity to those sites might be weaker than that to the target sites^22-25. There are several ways to manage contamination of molecules bound to those off-target sites. First, the use of several, at least two, different gRNAs would be recommended. Those molecules commonly observed in enChIP using distinct gRNAs would be true positives. Second, comparison of different conditions for enChIP would be effective in cancelling contamination of non-specific molecules and molecules bound to off-target sites. Examples of those comparison sets would be (i) stimulation (-) and (+), or (ii) different cell types such as T cells vs. B cells. Finally, quantitative analysis of binding of candidate molecules should be performed to confirm their specific binding to the target sites. It is preferable to prepare cells expressing only dCas9 but not gRNA as a negative control.

Using enChIP analyses, we were able to successfully identify a number of known and novel molecules interacting with specific genomic regions (Tables 1-3)^14-17. However, this technique failed to detect some other known proteins interacting with these regions. For example, STAT1 reportedly associates with the IRF-1 promoter upon IFNγ stimulation⁸, but our enChIP-SILAC analysis did not detect STAT1 as a protein induced to interact with this genomic region¹⁶. In addition, in the enChIP-MS analysis of telomeres, we did not detect shelterin proteins consisting of TRF-1 and TRF-2¹⁵, which have been shown to interact with telomeres²⁶. There are a few potential reasons for these discrepancies. First, the stoichiometry of binding of Stat1 to the IRF-1 promoter might be very low. It is reasonable that enChIP-MS, including enChIP-SILAC, detects proteins that are more abundantly associated with target genomic regions; hence, the analysis of more cells might be necessary to detect these proteins. Increases in the sensitivities of MS instruments would also contribute to the efficient detection of proteins with low stoichiometric binding. Second, some proteins, possibly including Stat1 and shelterins, might be difficult targets for MS analyses. Third, in our analysis of telomere-binding proteins¹⁵, the 3×FLAG-TAL proteins recognizing telomeres (3×FN-Tel-TAL) might have blocked the binding of shelterins to telomeres in a competitive fashion.

In contrast to the relative difficulty of detecting transcription factors binding to specific genomic regions using enChIP, we successfully identified epigenetic regulators such as histone modification enzymes using enChIP analyses. The success of this technique may be due to the fact that epigenetic regulators bind to a broad range of genomic regions; hence, more proteins per genomic region are available for MS. Because epigenetic regulators are increasingly recognized as important targets for drugs against intractable diseases such as cancer, enChIP would be a useful tool for the identification of epigenetic drug targets.

Materials

gBlock synthesis service	Life Technologies	Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service	IDT (Integrated DNA Technologies)	gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo	Addgene	51128
pSIR-GFP	Addgene	51134
pSIR-DsRed-Express2	Addgene	51135
pSIR-hCD2	Addgene	51143
TAL synthesis service	Life Technologies	GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1	Addgene	47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro	Addgene	51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG	Addgene	51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2	Addgene	51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo	Addgene	51260
anti-FLAG M2 Ab	Sigma-Aldrich	F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2	Sigma-Aldrich	F4049
DMEM medium for SILAC	Life Technologies	89985	Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC	Life Technologies	89986
L-Lysine-2HCl for SILAC	Life Technologies	89987	for Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC	Life Technologies	89989	for Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC	Life Technologies	89988	For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC	Life Technologies	89990	For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free	Roche Diagnostics	4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201	Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator	Zymo Research	D5205
Dynabeads-Protein G	Life Technologies	DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor	Promega	N2611
Isogen II	Nippon Gene	311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit	Zymo Research	R2050
LTQ Orbitrap Velos	Thermo Fisher Scientific		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC	Advance, Michrom Bioresources		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler	CTC Analytics		a component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis