अलगाव और<em> पूर्व Vivo</emVδ1 की> संस्कृति<sup> +</sup> सीडी 4<sup> +</sup> Γδ टी कोशिकाओं, एक Extrathymic αβT सेल पूर्वज
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
थाइमस, αβ टी कोशिकाओं और रीढ़ में अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की रीढ़ की हड्डी की पीढ़ी के लिए प्राथमिक अंग है, लंबे समय αβT केवल कोशिकाओं के स्रोत के रूप में माना गया है। फिर भी, थाइमिक पेचीदगी परिधि में भोले αβT कोशिकाओं का एक काफी कम उत्पादन के लिए अग्रणी जीवन में जल्दी शुरू होता है। फिर भी, यहां तक कि शतायु नये अधिग्रहीत रोगजनकों के खिलाफ प्रतिरोधक क्षमता का निर्माण कर सकते हैं। हाल के शोध से समारोह की थाइमिक नुकसान की भरपाई हो सकती है कि रास्ते में से हालांकि हमारी समझ अभी भी rudimental हैं, extrathymic αβT सेल विकास चलता है। γδ टी कोशिकाओं ऊतकों में मुख्य टी सेल सबसेट का गठन कि जन्मजात लिम्फोसाइट हैं। हमने हाल ही में दिखा कर एक γδ टी सेल सबसेट के लिए एक अब तक नाचीज बकाया समारोह जिम्मेदार माना कि सीडी 4 की दुर्लभ इकाई + Vδ1 + γδ टी कोशिकाओं भड़काऊ शर्तों में αβT कोशिकाओं में transdifferentiate कर सकते हैं। यहाँ, हम पीपरिधीय रक्त से इस पूर्वज के अलगाव और इसके बाद खेती के लिए प्रोटोकॉल rovide। Vδ1 कोशिकाओं सकारात्मक हम एक और चुंबकीय लेबलिंग तकनीक के साथ सीडी 4 + कोशिकाओं के दुर्लभ अंश को लक्षित जिसमें एक दूसरे कदम के द्वारा पीछा किया, चुंबकीय मोतियों का उपयोग स्वस्थ मानव दाताओं की PBMCs से समृद्ध कर रहे हैं। दूसरी लेबलिंग की चुंबकीय शक्ति पहला चुंबकीय लेबल में से एक से अधिक है, और इस तरह ब्याज की आबादी का, कुशल मात्रात्मक और विशिष्ट सकारात्मक अलगाव की अनुमति देता है। हम तो कोशिकाओं की क्लोनिंग और कुशलता के विस्तार के लिए और FACS विश्लेषण द्वारा उत्पन्न क्लोन की पहचान के लिए आवश्यक तकनीक और संस्कृति हालत परिचय। इस प्रकार, हम शुद्धि, संस्कृति और सीडी 4 + Vδ1 + γδ टी कोशिकाओं की पूर्व vivo विस्तार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। यह ज्ञान इस αβT सेल progenitor`s जीव विज्ञान से संबंधित हैं कि अध्ययन के लिए और आईडीई करने का लक्ष्य है, जो उन लोगों के लिए शर्त हैइसकी transdifferentiation में शामिल कर रहे हैं कि आणविक चलाता ntify।
Introduction
रीढ़ में, सेलुलर और प्रतिरक्षा के एक त्रिदोषन भाग में संरचित है कि प्रतिरक्षा अनुकूली रोगजनकों के खिलाफ रक्षा करने में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। एंटीजन की एक विस्तृत श्रृंखला की मान्यता टी कोशिकाओं के संबंध में थाइमस 1 में मुख्य रूप से उत्पादन किया जा ग्रहण कर रहे हैं जो hyperpolymorphic टी और बी सेल रिसेप्टर्स (TCR / बीसीआर), द्वारा मध्यस्थता है। बहां, अस्थि मज्जा से व्युत्पन्न hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी), थाइमस बीज और अंत में सभी टी सेल प्रजातियों को जन्म दे रही अच्छी तरह से परिभाषित चरणों के साथ अलग। और सीडी 8 – – थाइमस बोने पूर्वज सीडी 4 कर रहे हैं और इस तरह अपरिपक्व, डबल नकारात्मक (डी.एन.) thymocyte अंश का गठन। थाइमस व्युत्पन्न संकेत तो उनके वंश प्रतिबद्धता और αβ या γδ टी कोशिकाओं या तो में भेदभाव प्रेरित। DN2 / 3 thymocytes में कार्यात्मक रूप से पुनर्व्यवस्थित TCR-γ और TCR-δ श्रृंखला जीनों की अभिव्यक्ति सेलुलर प्रसार एक ड्राइव जो δTCR परिसरों, γ की ओर जाता हैγ δT कोशिकाओं 2,3 में भेदभाव को बढ़ावा देने चाहते हैं। इसके विपरीत, एक preTCR पीटी का निर्माण करने के लिए preTα साथ जोड़ी कर सकते हैं कि एक कार्यात्मक TCR-β श्रृंखला की पुनर्व्यवस्था, ट्रांसक्रिप्शनल DN3 thymocytes में TCR-γ श्रृंखला का मुंह बंद करने और सीडी 4 + 8 + डबल सकारात्मक thymocytes 4 में उनके संक्रमण लाती है । इस स्तर पर, TCR-α श्रृंखला के पुनर्संयोजन इस प्रकार इन कोशिकाओं अपरिवर्तनीय 5-9 में उत्पादन एक γδTCR नकारात्मक, TCR-α ठिकाना भीतर स्थित है कि TCR-δ ठिकाना को हटाने, होता है। पुन: व्यवस्थित αβTCRs बाद में औतोइम्मुिनित (नकारात्मक चयन) से बचने के लिए एक निश्चित सीमा से अधिक नहीं हो सकता है, जो दुर्बलता (सकारात्मक चयन) स्वयं एमएचसी बाध्य करने की उनकी क्षमता, के लिए चुने गए हैं। MHC वर्ग मैं या द्वितीय बंधन की उनकी क्षमता के अनुसार, चयनित αβT कोशिकाओं एकल सकारात्मक सीडी 4+ या सीडी 8 + टी कोशिकाओं, जो बाहर निकलें थाइमस के रूप में भोले टी कोशिकाओं में विकसित करना।
हालांकि, थाइमस की पेचीदगी जल्दी लगभग बुझा के बाद किशोरावस्था 10 है कि भोले टी कोशिकाओं की तेजी से कम उत्पादन के लिए अग्रणी जीवन में शुरू होता है। फिर भी, टी सेल पूल के आकार के बाद थाइमिक होमियोस्टैटिक टी कोशिकाओं के प्रसार को और लंबे समय रहते immunologic स्मृति 11 के प्रसार से ही भाग में समझाया जा सकता है, जो जीवन भर लगातार बना रहता है। नतीजतन, extrathymic टी सेल विकास होने चाहिए। हाल के शोध-पर जो extrathymic कार्यात्मक αβ टी कोशिकाओं 12-17 को जन्म साइटों दिया αβT सेल पूर्वज, विशेषता है कि पर्याप्त आकर्षण का फायदा हुआ है। फिर भी, एक थाइमस से स्वतंत्र αβT कोशिकाओं में अंतर यह है कि extrathymic αβT सेल व्यापारियों के बारे में विस्तृत ज्ञान हम वे इस तरह ले मार्ग पर है पृष्ठभूमि के रूप में के रूप में टूटा हुआ है।
हमने हाल ही में Vδ1 + के छोटे टी सेल इकाई की पहचान </sup> एक हल्के भड़काऊ माहौल में αβT कोशिकाओं में transdifferentiate कर सकते हैं स्वस्थ मानव दाताओं की परिधीय रक्त से अलग है, जो जब एक extrathymic αβT सेल prognitor 18, के रूप में सीडी 4 + γδT कोशिकाओं। दिलचस्प बात यह है और संभावित नए एंटीजन मान्यता प्राप्त किया जा सकता है, ताकि इस प्रकार, प्रदर्शनों की सूची विविधता का विस्तार करने के बाद थाइमिक टी कोशिकाओं के homeostatic प्रसार, Vδ1 सीडी 4 + कोशिकाओं की transdifferentiation नई टी सेल रिसेप्टर्स उत्पन्न करता है, के विपरीत और संरक्षण हो सकता नये अधिग्रहीत रोगजनकों के खिलाफ मेजबान। यह टी कोशिकाओं की प्लास्टिसिटी के लिए कहते हैं और extrathymic टी सेल के विकास के लिए एक अब तक नाचीज नए मार्ग कहते हैं।
उद्देश्य यह αβT सेल extrathymic विकास precursor`s ट्रिगर है कि उन मार्करों और अणुओं की पहचान करने के लिए लिम्फोसाईटिक स्रोतों से मात्रात्मक अलगाव, एकल कोशिका क्लोन की पीढ़ी और उनके कुशल विस्तार आवश्यक हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इसके सकारात्मक चुंबकीय सेल अलगाव के लिए Vδ1 और सीडी 4: एक दुर्लभ (टी) सेल इकाई के phenotype, जीव विज्ञान और समारोह का अध्ययन करने के लिए, अर्थात् Vδ1 + सीडी 4+ टी कोशिकाओं, हम दो मार्कर का इस्तेमाल किया। सीडी 4 monocytes औ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
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