Isolement et<em> Ex Vivo</em> Culture de Vδ1<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> cellules γδ T, un extrathymique αβT cellules progénitrices
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
Le thymus, l'organe primaire pour la génération de cellules T aß et épine dorsale du système immunitaire adaptative chez les vertébrés, a longtemps été considérée comme la seule source de cellules αβT. Pourtant, involution thymique commence tôt dans la vie conduisant à une sortie considérablement réduit de cellules αβT naïfs dans la périphérie. Néanmoins, même les centenaires peuvent construire l'immunité contre les agents pathogènes nouvellement acquises. Des recherches récentes suggèrent le développement des cellules αβT extrathymique, mais notre compréhension des voies qui peuvent compenser la perte de la fonction thymique sont encore rudimentaire. cellules γδ T sont des lymphocytes innées qui constituent le principal sous-ensemble de cellules T dans les tissus. Nous avons récemment attribué une fonction exceptionnelle jusqu'ici incompris à un sous-ensemble de cellules T de γδ en montrant que l'entité rare de CD4 + Vδ1 + γδ cellules T peuvent transdifférencier dans les cellules αβT dans des conditions inflammatoires. Ici, nous pournir le protocole pour l'isolement de cette ancêtre du sang périphérique et sa culture subséquente. Vδ1 cellules sont positivement enrichis à partir de PBMC de donneurs humains en bonne santé en utilisant des billes magnétiques, suivie d'une deuxième étape dans laquelle nous ciblons la fraction rares des cellules CD4 + avec une technique de marquage magnétique plus loin. La force magnétique de la deuxième étiquetage dépasse celui de la première étiquette magnétique, et permet ainsi l'isolement positif efficace, quantitative et spécifique de la population d'intérêt. On introduit ensuite l'état de la technique et de la culture requise pour le clonage et efficacement l'expansion des cellules et pour l'identification des clones générés par analyse FACS. Ainsi, nous fournissons un protocole détaillé pour la purification, de la culture et de l'expansion ex vivo de cellules CD4 + Vδ1 + yô Les cellules T. Cette connaissance est une condition préalable pour des études qui se rapportent à cette αβT progenitor`s de biologie cellulaire et pour ceux qui visent à IDEntifier les déclencheurs moléculaires qui sont impliqués dans son transdifférenciation.
Introduction
Chez les vertébrés, l'immunité adaptative qui est structuré dans le cellulaire et une partie de l'immunité humorale joue un rôle majeur dans la défense contre les pathogènes. La reconnaissance d'une large gamme d'antigènes est médiée par hyperpolymorphic T et B des récepteurs de cellules (TCR / BCR), qui en ce qui concerne les cellules T sont supposés être produite principalement dans le thymus 1. Celui-ci, les cellules souches hématopoïétiques (CSH), dérivées de moelle osseuse, le thymus semences et de différencier le long étapes bien définies finalement donné lieu à toutes les lignées de cellules T. Thymus progéniteurs ensemencement sont CD4 – et CD8 – et constituent donc la immature, double négatif (DN) fraction de thymocytes. Thymus signaux dérivés induisent alors leur engagement lignée et de la différenciation en soit des cellules T aß ou yô. L'expression de TCR-y et TCR-ô gènes de chaîne fonctionnellement réarrangés en DN2 / 3 thymocytes conduit à y δTCR complexes, qui entraînent une de prolifération cellulaireD promouvoir la différenciation en cellules γ de 2,3 AT. En revanche, le réarrangement d'une chaîne TCR-β fonctionnel, qui peut coupler avec preTα de construire un preTCR pT, induit la réduction au silence de la transcription de la chaîne TCR-γ dans les thymocytes DN3 et leur transition dans les thymocytes CD4 + CD8 + double-positifs 4 . A ce stade, la recombinaison de la chaîne TCR-α se produit, la suppression du locus TCR-δ qui se niche dans le locus TCR-α, abrogeant ainsi la production d'un γδTCR dans ces cellules irrévocablement 5-9. ΑβTCRs réarrangés sont ensuite sélectionnés pour leur capacité à se lier auto-MHC faiblement (sélection positive), qui ne peut dépasser un certain seuil pour éviter l'auto-immunité (sélection négative). Selon leur capacité de liaison I ou II du CMH de classe, les cellules αβT sélectionnés développer en cellules simple positif CD4 + ou T CD8 +, qui sortent du thymus lymphocytes T naïfs que.
Cependant, l'involution du thymus commence tôt dans la vie conduisant à exponentiellement réduit la production de cellules T naïves qui est presque éteinte post-adolescence 10. Néanmoins, la taille du pool de cellules T reste constante tout au long de la vie, qui peut être expliqué en partie seulement par une prolifération homéostatique post-thymique des lymphocytes T et la prolifération de long vécu mémoire immunologique 11. Par conséquent, le développement de cellules T extrathymique doit se produire. Des recherches récentes ont gagné activité importante qui a caractérisé progéniteurs des cellules αβT, qui au-extrathymique sites à donné lieu à aß fonctionnelle des cellules T 12-17. Pourtant, les connaissances détaillées sur extrathymique précurseurs de cellules que αβT indépendant d'un thymus se différencier en cellules αβT est aussi fragmentaire que le fond que nous avons sur la route qu'ils prennent de ce fait.
Nous avons récemment identifié la petite entité T-cellule de Vδ1 + </sup> cellules CD4 + γδT comme une cellule prognitor αβT extrathymique 18, qui, lorsqu'il est isolé à partir du sang périphérique de donneurs humains en bonne santé peut transdifférencier dans les cellules αβT dans un environnement inflammatoire doux. Il est intéressant et contraire à la prolifération homéostatique des lymphocytes T post-thymiques, transdifférenciation des Vδ1 cellules CD4 + génère de nouveaux récepteurs de cellules T, élargissant ainsi la diversité du répertoire, de sorte que potentiellement de nouveaux antigènes peuvent être reconnus et peut protéger l'hôte contre les agents pathogènes nouvellement acquises. Cela ajoute à la plasticité des cellules T et ajoute une nouvelle voie jusqu'ici incompris pour le développement de cellules T extrathymique.
L'isolement quantitative à partir de sources lymphocytaires, la génération de clones unicellulaires et leur expansion efficace sont essentiels pour l'objectif d'identifier les marqueurs et des molécules qui déclenchent cette cellule αβT precursor`s développement extrathymique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour étudier le phénotype, la biologie et la fonction d'une entité de cellules rares (T), à savoir les cellules Vδ1 + T CD4 +, nous avons utilisé deux marqueurs: Vδ1 et CD4 pour son isolement cellulaire magnétique positive. Vδ1 est un récepteur orphelin, alors que CD4 est exprimé sur les lymphocytes T auxiliaires, à un niveau inférieur sur les monocytes et les cellules dendritiques, et à un niveau très faible sur les cellules progénitrices hématopoïétiques.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
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