Imaging- और फ्लो के आधार पर सेल की स्थिति का विश्लेषण और 3 डी मेलेनोमा spheroids में कोशिका चक्र
Summary
We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.
Abstract
Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.
Introduction
बहुकोशिकीय 3 डी spheroids हालांकि यह है कि वे कई ठोस कैंसर के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में अधिक आम उपयोग में आ गए हैं कि हाल ही में है, दशकों के लिए एक ट्यूमर मॉडल के रूप में जाने जाते हैं। वे तेजी से जटिल, खर्चीला और समय लेने वाली विवो मॉडल में और सरल, कम लागत 2 डी monolayer मॉडल 1-6 के बीच एक मध्यस्थ के रूप में उच्च throughput दवाओं की खोज स्क्रीन में इस्तेमाल किया जा रहा है। 2 डी संस्कृति में अध्ययन अक्सर विवो में दोहराया जा करने में असमर्थ हैं। कैंसर के कई प्रकारों में से अंडाकार आकृति मॉडल विकास विशेषताओं, दवा संवेदनशीलता, दवा प्रवेश, सेल सेल बातचीत, ठोस ट्यूमर 6-11 इन विवो में देखा जाता है कि ऑक्सीजन और पोषक तत्वों और नेक्रोसिस के विकास के प्रतिबंधित उपलब्धता की नकल करने में सक्षम हैं। Spheroids अंडाकार आकृति 7 की परिधि में एक परिगलित कोर, कोर के आसपास के एक मौन या G1 गिरफ्तार किया क्षेत्र, और proliferating कोशिकाओं का विकास। इन क्षेत्रों के विकाससेल घनत्व, प्रसार दर और अंडाकार आकृति 12 के आकार के आधार पर भिन्न हो सकती है। यह इन विभिन्न उप-क्षेत्रों में देखा सेलुलर विविधता कैंसर के उपचार प्रतिरोध 13,14 में योगदान कर सकते धारणा रही है कि। इसलिए इन क्षेत्रों में कोशिकाओं का विश्लेषण करने की क्षमता अलग से समझ ट्यूमर दवा प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है।
सेल चक्र 15 के विभिन्न चरणों में अपमानित कर रहे हैं जो Cdt1 और geminin के फ्लोरोसेंट टैगिंग, – और हरे रंग (एजी Azami ग्रीन) – प्रतिदीप्ति ubiquitination सेल चक्र सूचक (FUCCI) प्रणाली लाल (को Kusabira नारंगी) पर आधारित है। इस प्रकार सेल नाभिक जल्दी एस में पीले, G1 में लाल और एस / जी 2 / एम चरण में हरे रंग दिखाई देते हैं। हम यहाँ दो पूरक विधियों का वर्णन दोनों कोशिकाओं G1 के आरोप में गिरफ्तार केंद्र या बाहरी proliferatin में रहते हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर या परख cytometry एक डाई प्रसार प्रवाह के उपयोग के साथ-साथ, कोशिका चक्र की पहचान करने के लिए FUCCI का उपयोग करजी अंगूठी, और अंडाकार आकृति के किनारे से व्यक्ति की कोशिकाओं की दूरी। या / और लक्षित चिकित्सा की उपस्थिति में समय की विस्तारित अवधि के लिए G1 गिरफ्तारी में रहने के लिए सक्षम हैं, और फिर से कर सकते हैं इन विधियों हम अंडाकार आकृति के केंद्र में hypoxic क्षेत्रों में है कि मेलेनोमा कोशिकाओं का प्रदर्शन किया, जहां हमारे पिछले प्रकाशन, में विकसित किए गए अधिक अनुकूल परिस्थितियों 7 उठता है जब सेल चक्र में प्रवेश।
Protocol
Representative Results
Discussion
अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण अंडाकार आकृति भीतरी G1 के आरोप में गिरफ्तार क्षेत्र की पहचान की है, और बाहरी परत proliferating। इस विधि को एक ऑप्टिकल अनुभाग का उपयोग लाइव spheroids पर इस्तेमाल किया जा सकता है, या तय अंडाक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ms. Danae Sharp and Ms. Sheena Daignault for technical assistance. We thank Dr. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for providing the FUCCI constructs, Dr. Meenhard Herlyn and Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, for providing cell lines, the Imaging and Flow Cytometry Facility at the Centenary Institute for outstanding technical support. We thank Mr. Chris Johnson and Dr. Andrew Barlow for Volocity software technical support. N.K.H. is a Cameron fellow of the Melanoma and Skin Cancer Research Institute, Australia. K.A.B. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (13/ECF/1-39). W.W. is a fellow of the Cancer Institute New South Wales (11/CDF/3-39). This work was supported by project grants RG 09-08 and RG 13-06 (Cancer Council New South Wales), 570778 and 1051996 (Priority-driven collaborative cancer research scheme/Cancer Australia/Cure Cancer Australia Foundation), 08/RFG/1-27 (Cancer Institute New South Wales), and APP1003637 and APP1084893 (National Health and Medical Research Council).
Materials
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 um | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 mL tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 mL tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
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