Optisk kontroll av levande celler elektrisk aktivitet av konjugerade polymerer

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

Möjligheten att manipulera den cellulära aktiviteten med en exakt rumslig och tidsmässig upplösning utgör en viktig strategi i neuro forskning och behandling av neurologiska och psykiatriska sjukdomar. Är ¹ Traditionella metoder baserade på elektrisk stimulering av celler med hjälp av elektroder placerade i närheten eller i kontakt med den målinriktade systemet, ^2, som kan vara av olika komplexitet (enda cell, cellulärt nät, hjärnsnitt, in vivo-hjärnvävnader). Under det senaste århundradet, har användningen av patch-clamp, metall och substrat integrerade elektroder en detaljerad bild av fysiologi och patofysiologi av enskilda nervceller och de fungerande mekanismer för neurala nätverk. Men lider elektrisk stimulering av viktiga begränsningar. Den första en är relaterad till en allmänt dålig spatial upplösning på grund av de fysiska dimensionerna hos elektroderna och deras fasta geometri, som inte lätt kan anpassastill komplexa organiserade system som biologiska vävnader. Dessutom kan problem i samband med elektrod impedans och av överhörning mellan stimulerings och registreringssystem försämras den slutliga signal-brusförhållande i mätningarna. ³ Å andra sidan kan användning av ljus för stimulering hjälper till att övervinna många begränsningar av den elektriska metoden. Först av allt, erbjuder oöverträffad rumslig (<1 pm) och temporal upplösning (<1 ms), vilket gör det möjligt att inrikta sig på specifika celltyper eller till och med sub-cellavdelningar. Dessutom är det mycket icke-invasiv eftersom den undviker någon fysisk kontakt med vävnaden av intresse och disentangles stimulans från inspelningen. Dessutom kan både ljusintensitet och våglängd regleras exakt och sålunda varierande stimuleringsprotokoll kan tillämpas. ^3,4

Dock inte de allra flesta djurceller inte fram någon specifik ljuskänslighet. Flera strategier för optisk stimulation har sålunda föreslagits, antingen utnyttja ljuskänsliga molekylära mediatorer i närheten eller inom cellerna, eller med användning av fotoaktiva anordning placerad externt, nära cellen. Den förstnämnda kategorin avser endogena mekanismer som stimulering via synlig eller infraröd (IR) ljus, liksom användning av antingen fotoisomeriserbara / fotoklyvbar föreningar eller genetiskt uttryck av ljuskänsliga molekylära ställdon (optogenetik). Den sistnämnda klassen inkluderar tekniker för exogen stimulering uppnås med användning av oorganiska nano / mikro-partiklar eller fotokonduktiva kiselsubstrat. ⁵ Trots detta har alla dessa system har ljusa sidor och nackdelar. I synnerhet är endogen absorption av celler i det synliga området svaga och inte tillförlitliga, och den åtföljande genereringen av reaktiva syretyper kan vara skadliga för cellen. I allmänhet är IR används för att inducera lokal termisk uppvärmning på grund av vattenabsorption, men extinktionskoefficienten för vatten är liten, vilket således kräver stRong infrarött ljus (från tiotals till hundratals W / mm ²⁾ som är svårt att leverera via standardmikroskopoptik och kan utgöra säkerhetsrisker för in vivo applikationer. Å andra sidan, foto omkopplingsbar placering i kasse föreningar har en tidsbegränsad verkan och kräver ofta UV-ljus som är svårt att avge på grund av begränsad genomträngning vävnad. Dessutom har de lider av diffusion problem med de aktiverade föreningarna vid fotolys utanför det belysta området. Slutligen har optogenetic verktyg får forskarna att rikta specifik cellulär subpopulation och underavdelningarna och snabbt fram som en av nyckelteknologierna i neurovetenskapliga forskningen. Men att sätta in en exogen DNA-segment via en virusvektor väcker viktiga säkerhetsfrågor, särskilt med tanke på antagandet om humanpatienter. ^5,6 Av dessa skäl är forskning om nya material och anordningar som kan cell optisk manipulation en extremt hett ämne.

Nyligen, en romanstrategi som bygger på användning av ljuskänsliga konjugerade polymerer, som kan effektivt omvandla en optisk stimulans i en modulering av cell elektrisk aktivitet, har föreslagits. Cell Stimulering av Polymer fotoexcitation (CSPP) teknik utnyttjar många viktiga aktivera funktioner typiska för organiska halvledare: de är i sig känslig för ljus i det synliga området, ⁷ de är biokompatibla, mjuk och formbar och deras mekaniska flexibilitet gör en intim gränssnitt med vävnad både in vitro och in vivo ^8-10. Bortsett från detta, kan de lätt funktion att bättre anpassa sig till gränssnittet med levande celler, och att aktivera det specifika excitation, sondering och avkänning kapacitet. ^11,12 dessutom de stöder elektronisk liksom jontransport, vilket gör dem idealiska för kombinationen elektronik annons biologi. ^13,14 Intressant, kan de arbeta i solceller läge, undvika behovet av att tillämpa en extern förspänning feller effektiv cell optisk stimulering. ¹⁵

Tillförlitligheten hos CSPP teknik har tidigare visats i flera system, inklusive primär neuroner, ^15,16 astrocyter, ¹⁷ sekundära cellinjer ¹⁸ och explanterade retinala vävnader. ¹⁶ I detta arbete, alla nödvändiga åtgärder för att tillverka en ljuskänslig bio-polymer gränssnitt ¹⁹ för optisk stimulering av in vitro-system beskrivs i detalj. Som en studie fall en proto organisk solceller blandning av region regelbundna poly (3-hexyltiofen) (rr-P3HT), som fungerar som elektrondonator, och fenyl-C61-smörsyra-syra metylester (PCBM), i egenskap av elektronacceptor användes. Eftersom det biologiska systemet, är humana embryonala njur (HEK-293-celler) används. Ett exempel på en fotostimulering protokoll med den relativa registrering av cellaktivitet via elektrofysiologiska mätningar tillhandahålls.

Den beskrivna plattformenär dock en allmän giltighet, och det kan lätt utvidgas till användningen av andra konjugerade polymerer (genom att justera lösningen förberedelseprocessen och deponerings parametrar), olika celltyper (med rätt att ändra cellodlings protokollet, plätering förfarande och begärd tid för cellsådd och spridning) och olika stimuleringsprotokoll (ljusvåglängd, stimuli frekvens och varaktighet, fotoexcitation densitet).

Protocol

1. Framställning av Fotoaktiva substrat Förbered en P3HT: PCBM-lösning (1: 1 vikt / vikt) i klorbensen vid en P3HT koncentration av 20 g / I. Blanda lösningen med en magnetisk omrörare under minst 4 h vid 60 ° C. Betrakta en volym av 150 | il av lösningen för varje substrat som skall framställas. Rena ITO-belagda objektglas (R s = 10 Ω / kvm, 18×18 mm 2, tjocklek 170 pm) med varandra bad avjoniserat vatten, aceton och isopropanol i en sonikator (10 min för varje steg…

Representative Results

Celler kan lätt odlas på P3HT: PCBM substrat, under förutsättning att ett lämpligt vidhäftningsskikt deponeras (som fibronektin användes i steg 3,2 av det beskrivna protokollet). P3HT: PCBM optisk absorptionstoppar i den gröna delen av det synliga spektrumet, men andra ljuskänsliga konjugerade polymerer kan väljas, enligt den föredragna fotostimulering våglängder intervall (Figur 2). Biokompatibilitet av dessa substrat har visats inte bara med cellinjer <sup…

Discussion

Kritiska steg i den rapporterade protokollet för in vitro optisk stimulering av celler avser främst valet av ljuskänsliga polymer, de termiska steriliseringsparametrar, intensiteten och varaktigheten av ljusstimuli. En P3HT: PCBM tunn film valdes här, eftersom det garanterar god tids och elektrokemisk stabilitet. Man bör dock notera att inte alla ljuskänsliga polymerer kan erbjuda analoga föreställningar, ²² närmare bestämt vid belysning. Dessutom, i detta fall valt värmesterilisering para…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020