प्रस्तावित कार्य (SPRI) assays, विशेष रूप से नुकीला मानव सीरम में पुनः संयोजक मानव विकास हार्मोन का पता लगाने के लिए, spri व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख के साथ सीधे परिणामों की तुलना द्वारा प्रत्यक्ष और परिलक्षित सतह plasmon अनुनाद इमेजिंग के नैदानिक संभावित आकलन है (एलिसा) किट।
सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर मानव विकास हार्मोन (एचजीएच) का पता लगाने के लिए संवेदनशील और चयनात्मक तरीके (के उच्च स्तर 50-100 एनजी मिलीलीटर – 1 और 0.03 एनजी मिलीलीटर के न्यूनतम स्तर – 1) रक्त संचार में चर स्तर के रूप में आवश्यक हो सकता है बदल शरीर क्रिया विज्ञान से संकेत मिलता है। उदाहरण के लिए, बचपन में होने वाली विकास संबंधी विकार, रक्त में HGH के स्तर को मापने से निदान किया जा सकता है। इसके अलावा, खेल में पुनः संयोजक एचजीएच के दुरुपयोग को न केवल यह भी प्रताड़ित करने के लिए गंभीर स्वास्थ्य खतरों को प्रस्तुत करता है एक नैतिक मुद्दा बन गया है। गैर-22 केडीए अंतर्जात स्तर बहिर्जात पुनः संयोजक एचजीएच (rhGH) प्रशासन के बाद ड्रॉप के रूप में एचजीएच दुरुपयोग को मापने के लिए एक लोकप्रिय रणनीति, कुल एचजीएच के लिए 22 केडीए एचजीएच के अनुपात का पता लगाने पर निर्भर करता है। सतह plasmon अनुनाद इमेजिंग (SPRI) अपवर्तक इंडस्ट्रीज़ के परिवर्तन की रिकॉर्डिंग के द्वारा प्रत्यक्ष (लेबल मुक्त) की निगरानी और biomolecular बातचीत के दृश्य की अनुमति देता है कि एक विश्लेषणात्मक उपकरण हैवास्तविक समय में सेंसर सतह से सटे पूर्व। इसके विपरीत, सबसे अक्सर इस्तेमाल किया वर्णमिति विधि, एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) परोक्ष रूप से एक रंग परिवर्तन लाती है कि एक सब्सट्रेट के बाद इसके अलावा विश्लेष्य एकाग्रता को मापने के लिए एंजाइम लेबल का पता लगाने के एंटीबॉडी का उपयोग करता है। संवेदनशीलता का पता लगाने में वृद्धि करने के लिए, प्रवर्धित SPRI सिग्नल की शक्ति को बढ़ाने के लिए एक सैंडविच परख प्रारूप और निकट अवरक्त क्वांटम डॉट्स (QDs) का उपयोग करता है। नुकीला मानव सीरम में पुनः संयोजक rhGH के प्रत्यक्ष SPRI का पता लगाने के बाद, spri संकेत लगभग अवरक्त QDs (नैनो SPRI) के साथ लेपित का पता लगाने के एंटीबॉडी के अनुक्रमिक इंजेक्शन से परिलक्षित होता है। इस अध्ययन में, प्रत्यक्ष और परिलक्षित SPRI के नैदानिक संभावित rhGH मानव सीरम में नुकीला और सीधे एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा किट की क्षमताओं के साथ तुलना को मापने के लिए मूल्यांकन किया गया था।
मानव विकास हार्मोन (एचजीएच) पिट्यूटरी ग्रंथि द्वारा उत्पादित और सीधे खून में जारी एक 191 अमीनो एसिड पेप्टाइड (22 केडीए) है। हाईपोथेलेमिक पेप्टाइड वृद्धि हार्मोन हार्मोन जारी (GHRH) और सोमातोत्रोपिन के बीच सहभागिता एचजीएच के गुणवाला स्राव प्रेरित। नतीजतन, एचजीएच का स्तर 0.03 एनजी / एमएल सीमा 1 में lows करने के लिए 50-100 एनजी / एमएल में ऊंचे स्तर से बदलती हैं। शरीर में कमी या एचजीएच से अधिक असामान्य शारीरिक लक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला उत्तेजित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एचजीएच से अधिक स्तरों gigantism 2 और मधुमेह 3 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। एचजीएच के समाप्त स्तरों वयस्कों 4 में नवजात शिशुओं में कम रक्त शर्करा, और कमजोर हड्डियों के घनत्व और अवसाद का कारण।
शरीर में वसा को कम करते हुए एचजीएच (rhGH) की पुनः संयोजक फार्म के प्रशासन दुबला मांसपेशियों में सुधार। यह एक एडीवी प्रदान कि शारीरिक शक्ति में सुधार के रूप में इस तरह के रूप में, इस पदार्थ पेशेवर और शौकिया खिलाड़ियों के लिए पसंद की दवा बन गयाप्रतिस्पर्धात्मक खेल में antage। rhGH अपनी उपस्थिति या anabolic प्रभाव का पता लगा सकते हैं कि परीक्षण के विकास पर ध्यान केंद्रित किया गया अंतरराष्ट्रीय शोधकर्ताओं द्वारा विश्व डोपिंग रोधी एजेंसी (वाडा) 5,6 और ज्यादा प्रयास से प्रतिबंध लगा दिया है।
एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) पूरे रक्त 7 में एचजीएच के निर्धारण के लिए पसंदीदा तरीका हो गया है। , एलिसा अच्छा संवेदनशीलता और चयनात्मकता पेशकश एक विश्वसनीय तकनीक है, यह अपेक्षाकृत समय और श्रम प्रधान है। इसके अलावा, एलिसा एंजाइमी टैग को रोजगार से एचजीएच के अप्रत्यक्ष पता लगाने पर निर्भर करता है। इसके विपरीत, सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) सीधे वास्तविक समय में लेबल के उपयोग के बिना एचजीएच का पता लगाने के लिए परमिट। एसपीआर के पीछे का पता लगाने के सिद्धांत एक पतली धातु की परत (सोने या चांदी) के साथ लेपित है कि एक चश्मे से मिलकर एक संवेदन सतह शामिल है; एक एक रंग ध्रुवीकृत प्रकाश धातु की सतह के साथ सूचना का आदान प्रदान करते हैं, "सतह plasmons" उत्पन्न कर रहे हैं। एक विश्लेष्य के बंधनधातु की सतह पर स्थिर एक सतह रिसेप्टर को तो विश्लेष्य एकाग्रता के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता है, जो एक स्थानांतरित गूंज डुबकी, जिसके परिणामस्वरूप में गूंज शर्तों perturbs। एसपीआर आधारित biosensors अब biomolecular बाध्यकारी घटनाओं और जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं 8-10 नजर रखने के लिए एक वास्तविक समय, लेबल मुक्त तकनीक का प्रस्ताव है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। हाल ही में, spri बहुसंकेतन के लिए जरूरत के जवाब में विकसित किया गया था (यानी, एक साथ कई बाध्यकारी घटनाओं की निगरानी) शास्त्रीय एसपीआर biosensors में संभव नहीं था, जो। इस प्रकार, spri एक साथ कई बाध्यकारी घटनाओं पर नजर रखने के लिए एक उपकरण के रूप में उभरा है। वर्तमान SPRI सिस्टम एक विशेष कोण और तरंग दैर्ध्य 10 पर प्रकाश के साथ उत्साहित है जो एक सतह के सूक्ष्म इमेजिंग के आधार पर कर रहे हैं। छवि तो एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) सरणी पर कब्जा कर लिया है।
तिथि करने के लिए, एचजीएच 11-14 पता लगाने के लिए विकसित की कुछ एसपीआर आधारित assays किया गया है। एक खास रणनीतिगैर-22-केडीए अंतर्जात स्तर बहिर्जात rhGH प्रशासन के बाद ड्रॉप के रूप में, isoform विधि 15 के रूप में जाना, कुल एचजीएच के लिए 22 केडीए एचजीएच के अनुपात का पता लगाने पर निर्भर करता है। हाल ही में, जुआन-फ्रेंको एट अल। 11 22 केडीए और मानव सीरम नमूनों में 20 केडीए एचजीएच isoforms की चयनात्मक का पता लगाने के लिए एक एसपीआर आधारित immunosensor के विकास पर सूचना दी डे। प्रत्येक isoform के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 0.9 एनजी मिलीलीटर -1 में पता लगाने की एक सीमा के साथ एक इंजेक्शन में एक साथ दोनों isoforms की माप की अनुमति के सोने संवेदक पर सीधे स्थिर थे। वैकल्पिक रूप से, एसपीआर एचजीएच से 13 उच्च विशिष्टता के साथ एंटीबॉडी स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। लक्ष्य विश्लेष्य की एकाग्रता का पता लगाने के SPRI सिस्टम की सीमा (<एनएम) से नीचे गिर जाता है, तो एक नैनोकणों के उपयोग (नैनो SPRI) के माध्यम से SPRI संकेत amplifying के लिए उपाय करने की है। इस तरह के एसपीआर आधारित प्रवर्धन अच्छी तरह से वी के लिए साहित्य 16-19 में प्रलेखित किया गया हैविश्लेष्य और सतहों के arious प्रकार।
इस काम में, spri और नैनो SPRI आधारित biosensors के विश्लेषणात्मक क्षमता का विशेष रूप से नुकीला मानव सीरम में rhGH का पता लगाने के लिए जांच की गई थी, और एलिसा के लिए सीधे अपनी पता लगाने की क्षमता की तुलना। निम्नलिखित मानकों की समीक्षा की और विचार किया जाएगा: पता लगाने के समय, संवेदनशीलता, गतिज प्रोफाइल, reproducibility और विशिष्टता।
एचजीएच, एक स्वाभाविक रूप से हार्मोन के अनियमित स्तर, मानव विकास और विकास को प्रभावित करने वाले कई चिकित्सा विकारों से जोड़ा गया है। इसके अलावा, rhGH के exogenous प्रशासन आमतौर पर उनके प्रदर्शन को बढ़ाने के लिए एक डोपिंग एजेंट के रूप में, यह मना किया है, भले ही एथलीटों द्वारा इस्तेमाल किया जाता है। अंतर्जात रूप से बहिर्जात एचजीएच भेद करने में कठिनाई से rhGH दुरुपयोग परिणाम का पता लगाने में चुनौतियां। जैसे, बहिर्जात एचजीएच का पता लगाने के लिए वर्तमान मंजूरी दे दी तकनीक 20 केडीए isoform के संबंध में 22 केडीए एचजीएच isoform के अनुपात को मापने पर निर्भर करता है। कई एचजीएच की माप के लिए isoform परीक्षण की मांग है इसलिए, सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला में समय की एक छोटी अवधि के भीतर एक साथ isoforms के बाद से, हम एक अच्छी जोड़ी के रूप में SPRI मंच माना जाता है। इसके अलावा, अंतर्जात एचजीएच स्तर इसलिए पहचान प्रणाली उच्च सपा के साथ आराम से इस सीमा को मापने के लिए सक्षम होना चाहिए खून में एक बहुत कम स्तर (0.03 एनजी / एमएल) के लिए उतार चढ़ावecificity। नतीजतन, हम भी एचजीएच के लिए नैदानिक उपकरण के रूप में इस अध्ययन में नैनो spri की क्षमता की जांच की और SPRI और शास्त्रीय प्रतिरक्षा एलिसा के साथ सीधे तुलना में।
इस अध्ययन से प्राप्त परिणामों के आधार पर, spri और नैनो SPRI विधि का मुख्य लाभ rhGH सांद्रता अधिक पारंपरिक विधि एलिसा की तुलना में एक तेज तरीके से मापा जा सकता है। नैनो SPRI प्रक्रिया में अतिरिक्त कदम के कारण 2 घंटा की आवश्यकता है, जबकि प्रत्यक्ष पता लगाने विधि के साथ एक नमूने में rhGH स्तर को मापने के लिए एक मानक अवधि 1 घंटा था। कुल मिलाकर, spri और नैनो SPRI प्रयोगों के साथ, एक नमूना के इंजेक्शन से पहले, एक अंशांकन कदम अत्यधिक की सिफारिश की है। इसके अलावा, यह केवल विशेष बातचीत प्रकट करने के लिए एक उच्च नमक धो बफर इंजेक्षन करने के लिए जरूरी है कि एक परिणाम के रूप में कुछ गैर विशिष्ट बातचीत में मानव सीरम परिणामों की तरह एक कच्चे नमूने का इंजेक्शन। यह एक धोने कदम बिल्कुल जरूरी है कि यह भी ध्यान देने योग्य हैसेंसर की सतह के अणुओं को अवरुद्ध की शुरूआत के बाद, अपार अणुओं को दूर करने के लिए। एलिसा समय की आवश्यकताओं के लिए एक के रूप में नमूने के विश्लेषण के लिए (~ 16-18 घंटा) तक अधिक से अधिक कर रहे हैं। फोकस का पता लगाने की निचली सीमा तुलना करने के लिए गया था के रूप परख की संवेदनशीलता, इस अध्ययन के लिए विशेष रूप से बढ़ाया है के रूप में एक लंबी ऊष्मायन समय की जरूरत है।
सतह के रसायन शास्त्र के चुनाव को एक आवेदन से दूसरे करने के लिए अलग-अलग होगा और इस SPRI तकनीक की सीमा में से एक के रूप में महसूस किया जा सकता है। इस अध्ययन में, एक विस्तृत श्रृंखला और रासायनिक linkers और अवरुद्ध अणुओं के संयोजन सेंसर की सतह के लिए rhGH का इष्टतम बाध्यकारी दक्षता निरीक्षण करने के क्रम में सही संयोजन को प्राप्त करने के लिए मूल्यांकन किया गया। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन में, बीएसए और खूंटी के संयोजन गैर विशिष्ट बातचीत को कम करने में अच्छी तरह से सेवा की। हालांकि, कब्जा ligand के एक aptamers था, जहां पिछले एक अध्ययन 17 में, खूंटी अकेले सबसे अच्छा अवरुद्ध अणु के रूप में कार्य किया। चरligand के लिए विश्लेष्य की है कि प्रभावित करते बाध्यकारी दक्षता बफर और तापमान भी पीएच पर निर्भर हैं। इसलिए, किसी भी आवेदन के साथ, इन चर अनुकूलित करने की आवश्यकता। इसके अलावा, यह चिप सतह के लिए ligand के इष्टतम खोलना एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है। स्थिर ligands की सांद्रता का एक सीमा के साथ एक अनुमापन प्रयोग अध्ययन शुरू करने से पहले किया जाता है। यह कोई अवशिष्ट तरल बचे हुए है यह सुनिश्चित रूप एलिसा के लिए के रूप में, प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम microplate दोहन से कुओं से धो बफर छानना करने के लिए किया गया था। किसी भी अवशिष्ट तरल लक्ष्य नमूना के संकेत पढ़ने के साथ दखल के रूप में पिपेट साथ बफर धोने को हटाने के लिए पर्याप्त नहीं था।
संवेदनशीलता के संदर्भ में, एलिसा (1 एनजी / एमएल) SPRI (3.61 एनजी / एमएल), लेकिन नैनो SPRI (9.20 स्नातकोत्तर / एमएल) के बराबर है जिससे rhGH के निचले जैविक स्तर पर माप सक्षम, परिमाण के आदेश तीन से संवेदनशीलता में सुधार 0.03 एनजी / एमएल। जैसा कि हम पहले एक रिपोर्ट के रूप में6,17, NanoEnhancers द्वारा दिया संकेत वृद्धि एक जन लोडिंग प्रभाव और फिल्म सोना nanostructures के लिए NIR fluorophores और प्रचार कर plasmons सतह के बीच मौजूद है कि मजबूत युग्मन के लिए जिम्मेदार ठहराया है। हालांकि, नैनो SPRI प्रक्रिया के लिए एक अतिरिक्त कदम कहते हैं, संवेदनशीलता के इस स्तर को विभिन्न दुकानों में SPRI प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों चौड़ा कर सकते हैं।
एलिसा ही आत्मीयता के मूल्यों को रिपोर्ट कर सकते हैं, जबकि SPRI एंटीबॉडी / rhGH बातचीत के (कश्मीर डी, कश्मीर एक और कश्मीर घ) के वैज्ञानिकों ने एक पूर्ण गतिज प्रोफ़ाइल प्रदान करता है। विभिन्नता का गुणांक (सीवी) अच्छा reproducibility, सुझाव SPRI (4.1%) और एलिसा (6.5%) के लिए 10% नीचे था। सेंसर चिप पर स्थिर कब्जा एंटीबॉडी एलिसा 96 अच्छी तरह से थाली में स्थिर एंटीबॉडी से अलग कर रहे हैं क्योंकि एलिसा और SPRI आत्मीयता मूल्यों से अलग हैं। नैनो spri के लिए के रूप में एक उच्च सीवी मूल्य (20%) मनाया गया। त्रुटि के एक स्रोत के रूप में योगदान कर सकते हैं कि कई मापदंडों रहे हैंसीवी निर्धारण के लिए रु। उदाहरण के लिए, विश्लेष्य का एक बहुत कम एकाग्रता मापा जा रहा है नैनो SPRI प्रयोग के साथ, NanoEnhancers के अलावा प्रक्रिया में एक और कदम के लिए कहते हैं और प्रयोग मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया गया था। नैनो SPRI और एलिसा के बीच एक बहुत अच्छा संबंध नुकीला मानव सीरम में rhGH का पता लगाने के लिए हासिल की थी। अंत में, एलिसा विधि ही यह एचजीएच के साथ मामला है यह मुश्किल है, वास्तविक समय की निगरानी और बहुसंकेतन आवश्यकता होती है स्थितियों में उपयोग करने के लिए बनाता है, जो समय लगता है, लेकिन एक विश्वसनीय तकनीक हो सकता है। इसके अलावा, spri एलिसा पर प्रदान करता है कि इस अध्ययन में सीधे जांच नहीं था कि एक अधिक आकर्षक फीचर, एक साथ वास्तविक समय में बातचीत के सैकड़ों उपाय करने की क्षमता है। इसलिए भविष्य में, नैनो SPRI विधि एक व्यवहार्य नैदानिक नैदानिक उपकरण के रूप में अपनी क्षमता की जांच के क्रम में विभिन्न सांद्रता में सीरम में मौजूद कई बायोमार्कर साथ वास्तविक समय में (बहुसंकेतन) का पता लगाने के लिए मूल्यांकन किया जाएगा।
The authors have nothing to disclose.
NanoManufacturing Innovation Consortium for funding support.
Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody | Acris Antibodies | DM1015 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Bioreagents | BP671-10 | |
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody | Acris Antibodies | AM09304BT-N | |
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | TCI America | D1601 | |
Ethanolamine | Acros Organics | 141-43-5 | |
Ethanol | Fisher Chemicals | BP2818-4 | |
Human HGH ELISA Kit | invitrogen | KAQ1081 | |
Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | |
Rabbit IgG Antibody | Sigma Aldrich | I5006 | |
11-mercaptoundecanoic acid | Sigma Aldrich | 450561 | |
Nanostrip | Cyantek | ||
N-hydroxysuccinimide | Sigma Aldrich | 130672 | |
Phosphate Buffer Saline | Invitrogen | 00-3002 | |
Polyethylene glycol (800 Da) | Sigma Aldrich | 729108 | |
Recombinant Human Growth Hormone | Calbiochem | 869008 | |
Sodium Acetate | Sigma Aldrich | 127-09-3 | |
Sodium Chloride | Fisher Chemicals | 7647-14-5 | |
Streptavidin coated near infrared quantum dots | Life Technologies | Q10171MP | |
UV/Ozone Procleaner | Bioforce Nanosciences | ||
Microwave reactor | CEM Corporation | Discover system | |
SPRi-Arrayer | LabNext Xactll Microarray System | ||
SPR biochip | HORIBA | ||
SPRi-Lab+ | HORIBA | ||
Synergy Mx Multimode Microplate reader | BioTek | ||
ScrubberGen | HORIBA | Data Analysis software |