Flowcytometri kan anvendes for å vurdere tilstanden til kromatin i T-celler. Denne protokollen tillater forskere å tolke bevis for kromatin decondensation under T-celleaktivering påvist ved en økning i den midlere florescence intensitet (MFI) av fluorescerende Histone H3-antistoffer
Under en passende immunrespons, hvilende T-celler blir aktivert ved antigen-presentasjon til deres antigen-spesifikk T-cellereseptoren. Dette fører til klonal proliferasjon av bare de T-celler som bærer en reseptor som gjenkjenner antigenet. Chromatin decondensation er et kjennetegn på T-celleaktivering og er nødvendig for T-celler til å tilegne seg evnen til å spre seg etter antigen engasjement. Denne endringen i kromatin kondensasjon kan påvises ved hjelp av antistoffer dannet mot histonproteinene. Disse antistoffene kan ikke binde seg til sine epitoper i naive T-celler, så vel som de kan i aktiverte T-celler. Vi beskriver hvordan man samtidig flekke T-celle-spesifikke overflatemarkører, spor levedyktighet med et fikses død celle flekken, og måle kromatin status via intracellulære farging av Histone H3 proteiner. Fargede celler blir analysert ved strømningscytometri og kromatin kondensasjon status er målt som den midlere fluorescensintensitet (MFI) av Histone H3 flekken. Chromati decondensation under T-celleaktivering er vist som en økning i MFI
Strømningscytometri er et laserbasert teknologi utviklet for analyse av flere fysiske og fluoriserende parametere i cellepopulasjoner. Denne teknologien fungerer som suspenderte celler i en strøm av væske møter en laser, spennende fluorescerende markører på eller inne i cellene. Disse markørene og deretter sende ut lys som blir detektert og kvantifisert ved hjelp av fotomultiplikatorrør. Mens flowcytometri har tradisjonelt blitt brukt for å identifisere populasjoner av celler, har det vist seg å være en nyttig teknologi når man studerer en rekke celle egenskaper inkludert cellemembranintegritet, protein-protein interaksjoner og protein handel 1-3. Vi har utviklet en protokoll som gjør denne teknologien som skal brukes til å detektere tilstanden av kromatin i T-celler når de blir aktivert in vitro 4. Vi har også brukt denne protokollen for å undersøke mekanismen for aktivering-indusert kromatin decondensation av T-celler 5.
T-celle activation og spredning er avgjørende for en riktig immunrespons. T-celler, en spesifikk undergruppe av lymfocytter i immunsystemet, er nødvendig for riktig immunresponser og utvikling av immunologisk hukommelse. Aktivering blir initiert når et antigen blir presentert i sammenheng med de store kompatibilitet komplekset til T-cellereseptoren (TCR) er plassert på den ekstracellulære overflaten av hvilende T-celler (oversikt i 6). Dette utløser en serie dynamiske og høyt organisert molekylære hendelser innen T-celler som kulminerer i en økning i intracellulær Ca2 + -konsentrasjon 7 og den nukleære translokasjonen av transkripsjonsfaktorer som kreves for aktivering (oversikt i 8-10). Når aktivert, T-celler få muligheten til å svare på interleukin-2 (IL-2), en potent vekstfaktor som utnytter JAK (Janus kinase) / STAT (Signal Svinger og Activator av transkripsjon) veien til å kjøre klonal spredning av aktiverte T celler 11. I korthet, IL-2-stimuleringresulterer i fosforylering av STAT proteiner, en familie av latent cytosoliske transkripsjonsfaktorer. Når fosforylert, STAT proteiner dimerisere, translocate til kjernen og kjøre uttrykket av gener, inkludert de som er involvert i cellesyklusprogresjon. I T-celler, IL-2 signaler via STAT5, som er nødvendig for T-celleformering 12,13.
For å oppnå en klonal ekspansjon av aktiverte T-celler, må de celler som ikke har opplevd antigen-TCR inngreps (naive T-celler), har en mekanisme for å ignorere de potente effekter av IL-2. Dette oppnås gjennom regulering av kromatin status. Naive T-celler har en kondensert kromatin som forbyr STAT5-DNA engasjement som svar på IL-2 stimulering. Ved aktivering, kan kromatin decondenses og STAT5 tilgang arrangører av målet gener, tillater klonal spredning fire. Interessant, er ikke denne endringen i kromatin status avhengig epigenetisk modifikasjon av histon Proteinkonns (for oversikt, se 14) som vi observerte ingen global endring i histone modifisering under T-celleaktivering fire.
Mens du utfører disse studiene, oppdaget vi at antistoffer dannet mot histonproteiner hadde også problemer med å få tilgang til sine epitoper i naive celler, men som ved aktivering kunne lettere binde sine epitoper 4. Således antistoffbinding til histoner tjener som en avlesning for kromatin kondensasjon status. Her presenterer vi metoden å bruke flowcytometri å oppdage fluorescently konjugert Histone H3 antistoffer for å vurdere kromatin status i T-celler. Kromatin kondens i en populasjon av celler måles som gjennomsnittlig florescence intensiteten (MFI) av Histone H3 farging. I forbindelse med T-celleaktivering, MFI av Histone H3 flekker øker, betegner decondensation av kromatin. I tillegg til å måle kromatin status via intracellulære Histone H3 flekker, denne protokollen incorpora ogsåoverflaten tes flekker og fikses flekken for levende celler, tillater analyse av subpopulasjoner av celler.
Vi utviklet en protokoll som gjør det mulig for vurdering av kromatin kondens i T-celler. Det er avhengig av den enkle observasjon at Histone H3-antistoff ikke kan få tilgang til sine epitoper lett i naive celler, men ved T-celleaktivering, disse samme antistoffene er i stand til å binde seg til sine epitoper. Ved å sammenligne MFI av Histone H3 flekker mellom behandlingsgruppene, kan den relative graden av kondens eller decondensation bestemmes. Vi har brukt denne protokollen for å bestemme relativ kondens status under thymocytt utvikling og under T-celleaktivering fire. Vi har også brukt denne protokollen for å undersøke hvilke mekanismer som styrer decondensation prosessen fem.
Denne protokollen er avhengig av bruk av et Histone H3-antistoff for å påvise kromatin kondensasjon status. Siden det er ingen global endring i histone modifisering under T-celleaktivering 4, er vi i stand til å bruke en H3K4me1 antistoff for å vurdere kromatinstatus i denne protokollen. Vi har brukt antistoffer dannet mot umodifisert Histone H3; Men det signal som frembringes var mye svakere samlet. I vår erfaring, antistoffer dannet mot modifisert Histone H3 fungere bedre i immunfluorescens og flowcytometri analyser, mens antistoffer mot umodifisert Histone H3 fungere bedre i Western blot. Det må bemerkes at det også er mulig å anvende antistoffer dannet mot andre histonproteinene, selv om vi ikke har forsøkt det.
Den Perm / Block og Histone H3 antistoff trinnene er de mest kritiske trinn i protokollen. Mengden av Perm / blokk løsning som brukes må optimaliseres hver gang lager Perm oppløsningen er gjort. Dette kan gjøres ved å sammenligne resultatene av forskjellige fortynninger av stamløsningen. Et typisk forsøk er å sammenligne kromatin status hos naive T-celler til de aktiveres i 3 timer (figur 4). Man bør velge den utvanning som produserer den største endringen i MFI løpettidsrommet analyseres. Stamløsningen kan fortynnes i PBS + 2% for å senke Perm / Block styrke ved først å resuspendere cellene i så mye som 100 ml PBS + 2% etter trinn 3.4, og deretter tilsetning av Perm / Block i trinn 3,5. En tilsvarende pilotforsøk bør brukes til å teste forskjellige fortynninger av det fluorescens-konjugert antistoff Histone H3 hver gang en ny sats av antistoff er merket. Disse trinnene er særlig avgjørende for en vellykket påvisning av kondens forskjeller tidlig i T-celleaktivering (for eksempel innen 3 timer fra aktivering). Av og til er det celler som ikke får permeabilized og dermed vil ikke flekker med Histone H3 antistoff. Dette kan skje hvis cellene ikke resuspendert godt når du legger til Perm / Block eller hvis Perm / Block er ikke sterk nok. Disse cellene vil vises som hendelser presset mot aksen når visualisere et histogram av Histone H3 farging. Siden disse hendelsene vil skew den totale MFI, kan disse hendelsene utelates fra analysen av gating normalfordeling Histone H3 positive celler. Assistanse kan bli funnet i problemløsing (tabell 1).
Inkludering av en festbar død celle flekk tillater vurdering av cellelevedyktighet i analysen. Dette er helt avgjørende ved manipulering av T-celleaktivering fordi visse stimuli kan indusere celledød. I et slikt tilfelle kan Histone H3 antistoffet binder histoner i døde celler annerledes enn levende celler, noe som fører til feiltolking av resultatene.
Denne protokollen er konstruert for bruk i 96-brønners plateformat, som tillater en høy gjennomstrømning analyse av kromatin status. En milt fra en 6-8 ukers gammel kvinnelig mus vil typisk gi mellom 60-90 millioner celler ved hjelp av protokollen. Etter farging protokollen krever 2 millioner celler per prøve, kan man lett analysere multiple behandlingsgrupper og tidspunkter i tre eksemplarer med en enkelt milt på en enkelt 96-brønners plate. Det er mulig å perform protokollen med mindre celler per prøve; imidlertid, på grunn av antallet av sentrifugeringstrinn og den iboende tap av celler i hvert av disse trinn, er det ikke tilrådelig å redusere antall celler ved mye. Vi har fullført protokollen med 1 million celler per prøve.
Vi brukte denne protokollen for å undersøke status kromatin i CD4 + T-hjelperceller og CD8 + cytotoksiske T-celler. Dette er gjort mulig ved at protokollen omfatter standard overflatefarging. Protokollen kan lett tilpasses for undersøkelse av kromatin i andre lymfocytsubpopulasjoner ved hjelp antistoffer mot befolkningsspesifikke overflatemarkører. Denne protokollen kan også lett tilpasses til andre celletyper, så lenge antistoffer som gjenkjenner relevante overflatemarkører er tilgjengelige og riktig fiksering / permeabilization betingelser er kjent.
The authors have nothing to disclose.
Dette prosjektet ble støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (5 P20 RR016461 og 8 P20 GM103499), National Science Foundation (EPS-0903795). Ytterligere støtte fra Furman University forskning og faglig vekst og Furman Advantage utmerkelser.
100mm tissue culture dish | BD Biosciences | 353003 | |
Precleaned frosted microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh | Fisher Scientific | 22363548 | |
3mL syringe, Luer-Lok tip | BD | 309585 | |
Falcon 50mL polypropylene conical tube | Corning | 352098 | |
LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit | Life Technologies | L23102 | Life Technologies sells versions of this kit with different colors |
Fc Block | BD Biosciences | 553142 | |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
Normal rabbit serum | Sigma-Aldrich | R9133 | |
Anti-H3K4me1 antibody | Abcam | ab8895 | |
R-Phycoerythrin conjugation kit | Abcam | ab102919 | Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used |