DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
Bireysel myofibers büyük, çok organize sinsityal hücrelerdir. Kas birkaç hücre kültürü modeli vardır; Ancak, bu modeller tam olgun myofibers içine ayırt yok onların ana sınırlama olarak var. Örneğin, C2C12 ve L6 hücre çizgileri farelerde ve sıçanlarda, sırası ile 1-4 elde edilir. Serum açlık koşullarında, tek çekirdekli "miyoblast gibi" hücreler çoğalması ateşkes hücre döngüsü çekilmesi geçmesi ve sarkomer ile çok çekirdekli hücreler oluşturan Miyojenik programa girmek, miyotüplerinin olarak anılacaktır. Uzun süreli kültür koşulları ile miyotüpleri kasılma özellikler gösterebilir ve kültürde "seğirme". İnsan hücre hatları da hemen 5 tespit edilmiştir. Bu ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına ek olarak, tek çekirdekli miyoblastlar kas ve miyotüpler oluşturacak serum açlık benzer koşullar altında izole edilebilir. Bu hücre hatları ve birincil miyoblast kültürleri çok kullanımı vardırful bu plasmidler ile transfekte ya da virüs ile transduse ve temel hücre biyolojik süreçleri incelemek için kullanılabilir, çünkü. Miyotüpler oluşturmak için uyarılan Ancak, bu hücreler, hatta, olgun kas örgütün belirgin özelliklerinden birçoğu yoksundur. Özellikle, miyotüpleri bireysel olgun myofibers çok daha küçüktür ve myofibers normal şeklini yoksundur. Kritik, miyotüpleri enine (T) tübüller eksikliği, myoplasm boyunca verimli Ca 2+ serbest bırakılması için gerekli membranöz ağ.
Birincil miyoblast veya myojenik hücre hatlarına alternatif bir yöntem olgun myofibers kullanarak gerektirir. Transgenesis etiketli proteinlerin ekspresyonunu belirlemek için kullanılabilir, ancak bu yöntem pahalı ve zaman alıcı bir iştir. Fare kas in vivo elektroporasyon hızı ve güvenilirliği 6-10 için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır.
In vivo elektroporasyon ve myofibers ha etkin izolasyon yöntemleriFare fleksör digitorum brevis (FDB) kas 6 için optimize oldum. Yöntemler hali hazırda tamamlanmış ve plazmidlerden in vivo ifadenin uyarılması için minimal invaziv girmektedir. Bu yaklaşım artık sarcolemma 6,7 lazer bozulması sonrasında görüntüleme dahil olmak üzere yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemleri ile kombine edilir. Floresan boyalar ve floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu kombinasyonu, olgun myofibers hücre, biyolojik işlemleri izlemek için de kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo olarak, floresan etiketli proteinler çalışma elektroporasyon kullanımı ideal sadakatle kas tüm hücre yapısını taklit Uygun bir hüre hattı modellerinin olmaması ile kas çalışma için uygundur. Bu protokol lazer yaralama sonra protein lokalizasyonu ve translokasyon ayrıntılı görüntüleme sağlamak için elektroporasyon ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanımını açıklar. Bu yöntem hücre iskeleti yeniden, insan ticareti ve füzyon gibi diğer hücresel süreçl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NS047726, NS072027 ve AR052646 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından hibe desteklenmiştir.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
References
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
