This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial cells for use in a field portable electric cell-substrate impedance sensor. The protocol for running a rapid drinking water toxicity test with the sensor is also described.
This manuscript describes how to prepare fluidic biochips with Rainbow trout gill epithelial (RTgill-W1) cells for use in a field portable water toxicity sensor. A monolayer of RTgill-W1 cells forms on the sensing electrodes enclosed within the biochips. The biochips are then used for testing in a field portable electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) device designed for rapid toxicity testing of drinking water. The manuscript further describes how to run a toxicity test using the prepared biochips. A control water sample and the test water sample are mixed with pre-measured powdered media and injected into separate channels of the biochip. Impedance readings from the sensing electrodes in each of the biochip channels are measured and compared by an automated statistical software program. The screen on the ECIS instrument will indicate either “Contamination Detected” or “No Contamination Detected” within an hour of sample injection. Advantages are ease of use and rapid response to a broad spectrum of inorganic and organic chemicals at concentrations that are relevant to human health concerns, as well as the long-term stability of stored biochips in a ready state for testing. Limitations are the requirement for cold storage of the biochips and limited sensitivity to cholinesterase-inhibiting pesticides. Applications for this toxicity detector are for rapid field-portable testing of drinking water supplies by Army Preventative Medicine personnel or for use at municipal water treatment facilities.
Det övergripande målet var att utveckla en metod för cellsådd, lagring och testning av fluid biochip i ECIS biosensor. Målet för utvecklingen av denna biosensor var att träffa amerikanska armén specifikationer för ett fält bärbar enhet som kan upptäcka eventuell förorening av dricksvattentäkter som används av soldater. Kraven på toxicitet sensorn var att det kunde upptäcka ett brett spektrum av giftiga industri föreningar snabbt (inom en timme) i koncentrationer som är relevanta för människors hälsa, att anordningen är fält portabel och biologiska komponenter skulle ha en hållbarhetstid minst nio månader. Kylning, men inte frysa, av färsk komponenter var acceptabelt.
Historiskt sett har fält bärbara vatten testning av teknik med en biologisk komponent till dem (såsom antikroppar, enzymer, eller nukleinsyror) varit analytspecifik 1-3. Nackdelen med dessa typer av biosensorer är att de kommer only detektera en typ av kemikalie i taget. Flera sensorer behövs om man misstänker att fler än en kemikalie är närvarande. Om en specifik sensor är inte i testrepertoaren kan kemiska föroreningar i vattnet lätt gå oupptäckt.
Breda toxicitets sensorer, å andra sidan, har potential att fylla denna tekniska klyftan. Dessa har oftast en cellulär komponent till dem 4-8. Fördelarna med breda toxicitets biosensorer är att de kan detektera närvaron av ett brett spektrum av kemiska föroreningar, inklusive blandningar och okända, i en relativt kort tid 5,9,10.
Konceptet att använda mätning av elektrisk impedans av cellmonoskikt som en möjlig toxicitet sensor, som också är känd som elektrisk cell-substrat impedans avkänning (ECIS), beskrevs först av Giaever och Keese 11. Under de senaste två decennierna har det visat sig vara en känslig indikator på cell VIABbilitet och cytotoxicitet. I grund och botten, är cellmonoskiktet som vidhäftar till elektroderna på de biochips utsätts för hög frekvens och låg spänning och strömstyrka växelströmsignal. Den sammanflytande monoskikt av celler hindrar flödet av elektroner. När integriteten hos cellmonoskiktet äventyras (såsom när en giftig kemikalie införs), registrerar ECIS sensorn en förändring i den elektriska impedansen 11-14. Figur 1 illustrerar principen för ECIS i förhållande till cellmonoskiktet på biochip .
Figur 1:.. Principen om ECIS Illustration av en cell monolager på en biochip med förenklad ECIS läsare elektriskt schema Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Metoder för sådd, lagring och testning av fluid biochips innehållandemonolager av RTgill-W1 celler på fluid biochips i ett ECIS biosensor beskrivs här. Fluidic biochips kan lagras i upp till 9 månader i ett kylt tillstånd och kan levereras i en kall lagringsbehållare, för att testa dricksvatten supplies.The medföljande ECIS läsare, eller testenheter, levereras separat. De biochips har två komponenter till dem; ett övre polykarbonatskikt med två separata fluidkanaler och ett nedre elektroniska skiktet som innehåller fyra elektroderna per kanal för impedans avkänning. Det finns 10 arbetselektroder per block; varje elektrod är 250 | j, m i diameter. De monterade biochips har guldelektrodanslutningar för att förvärva impedans avläsningar när de sätts i ECIS testenheten. Var och en av de två inneslutna fluid U-formade kanaler kommer att hålla 2 ml av RTgill-W1 cellsuspension. Figur 2 visar en fluid biochip i ECIS läsaren med en förstoring av ett sammanflytande celler på ett enda avkännande elektrod.
<p class= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">ECIS tekniken utvecklades väl i laboratoriemiljö och kunde upptäcka eventuella vattenföroreningar vid koncentrationer som är relevanta för människors hälsa. Portabilitet och förpackning av tekniken gör det främjar fältanvändning.
Kritiska steg i protokollet för framgången av tekniken är följande: 1) Bibehåll aseptiska förhållanden under odling, sådd, och utfodring av biochips, 2) Håll sådda biochips i kylda förhållanden tills redo för att testa eftersom RTgill-W1 celler kommer inte att överleva mycket länge när de utsätts för temperaturer över 25 ° C, 3) väg noggrant L-15ex i pulvermedieflaskor och noggrant mäta vattenproven för att undvika att producera falska positiva, som kan orsakas av en förändring i osmolalitet media snarare än prov toxicitet, 4) Följ användarinstruktioner på ECIS skärmen för att köra testerna. Mjukvaran i läsaren kommer att varna användaren om en biochip är oacceptabelt för testning (baserat på initiala impedans avläsningar) när biochip är först in i läsaren. Om impedansen nivåerna är oacceptabla för att testa, kommer programmet inte tillåter användaren att gå vidare med att testa tills en ny biochip används. Orsaker till oacceptabla impedans avläsningar är oftast på grund av en liten förskjutning av biochip elektroderna med ECIS läsare stift eller vätskeläckage utmed en av limning kanterna av biochip.
Det finns några gränser för denna teknik på grund av ECIS sensorn endast testats med dricksvatten och inte med ytvatten. De RTgill-W1 celler som finns på biochip kan inte tolerera frysning eller temperaturer mycket över 25 ° C under längre tidsperioder (tidsram kan vara från timmar till dagar beroende på temperaturen. De biochips fungerar bäst i ett temperaturområde från kyld till rumstemperatur 7. De är redo för omedelbar användning, dock rätt efter att removed från kylförvaring. Bärbara kalla förvaringsbehållare för närvarande används av armén personal i fält för temperaturkänsliga leveranser. Samma behållare kan användas för seedade biochip transport.
En annan gräns för denna teknik är att även om det är en toxicitet sensor bredbands, inte svarar bra, om alls, till kolinesteras-hämmande föreningar, såsom vissa bekämpningsmedel. För att fylla denna resursbristen är ECIS sensorn utformad för att användas tillsammans med en kommersiellt tillgänglig snabb bekämpningsmedel testanalysen vid provning vattenprov för att förse användaren med ett bredare spektrum av toxicitetstester. Satsen är en snabb enzymatisk analys utformad för att detektera fosfororganiska och karbamat bekämpningsmedel inom 30 minuter.
ECIS sensor kompletterar wqas-PM (Water Quality Analysis System – Förebyggande medicin) fält vatten testsystem, som för närvarande används av militär preventiv medicin personal för att upptäcka, arsenic, bly, eller cyanid i ett dricksvattenprov. Även om ECIS sensorn inte kommer att identifiera vad det främmande ämnet är, kommer det att ange om vissa metaller eller organiska föreningar är närvarande, vilket tyder på att vattnet inte kan vara lämpliga för mänsklig konsumtion. De ECIS Testresultaten finns inom en timme. Vattenproven kan sedan skickas ut för vidare analys för identifiering av det främmande ämnet, om det finns ett positivt testresultat.
Som beskrivits ovan, är ECIS läsaren utformad för att vara en del av ett system som innefattar en separat enzymatisk ACE kit för att täcka ett brett spektrum av förorenings upptäckt. Båda dessa läsare förpackas i en kraftig väska för transport fält för fältbruk av soldater.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the US Army Medical Research and Materiel Command and by the Small Business Innovation Research and Small Business Technology Transfer program; Contract No. W81XWH-13-C-0093. We would like to thank Dr. Lucy Lee at the University of Fraser for being our RTgill-W1 cell culture mentor, and to acknowledge Dr. Niels Bols of Waterloo University for the development of the RTgill-W1cell line.
Fetal bovine serum | Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com | 16000-085 | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (10%). |
Fibronectin, bovine plasma | EMD Millipore Corp. www.emdmillipore.com | 341631-1 mg | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Mix with L-15 media for a concentration of 10 ug/mL and freeze @ -20 °C in aliquots. Use as substrate for biochips. |
L-15 media without L-glutamine | Lonza www.lonzabioscience.com | 12-700F | Basal media for cell culture and feeding biochips. Store at 6 °C. |
L-15ex powdered media with phenol red | US Biological www.usbio.net | L1501 | Media is weighed out in 60 mg aliquots in 0.1 dram vials and stored at 6 °C in foil pouches with dessicant packs. Nine month shelf-life. Mixed with 10 mL of water sample for testing in biochips. |
PBS, w/o Ca++ or Mg++ | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-516F | Store at room temperature. Used for rinsing media when trypsinizing cell culture flasks. |
Trypsin, EDTA | Lonza www.lonzabioscience.com | CC-5012 | Store @ -20 °C. Thaw at room temperature and use to trypsinize cell culture flasks. |
T175 culture flasks | Fisher Scientific www.fishersci.com |
12-565-30 | Used for culturing RTgill-W1 cells. |
Bleach | Chlorox www.chlorox.com | Diluted to 20% with millique or distilled water for cleaning ECIS chips. Any household bleach is acceptable. | |
70 % ethyl alcohol | For disinfecting biohood surfaces and any materials being placed in biohood. | ||
Rainbow trout gill cells (RTgill-W1) | American Type Tissue Culture Collection www.atcc.org | CRL-2523 | Cells cultured and used for biosensor (seeding biochips). |
GlutaMAX-1 Supplement, 200 mM | Lonza www.lonzabioscience.com | 35050-061 | Store at room temperature. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Penn/Strep Stock 10K/10K | Lonza www.lonzabioscience.com | 17-602E | Store @ -20 °C. Thaw @ room temperature before use. Ingredient for complete L-15 cell culture media (1%). |
Pharmed BPT tubing | U.S. Plastic Corp. www.usplastic.com | 57317 | Cut in 27 mm sections and autoclaved. Used for seeding biochips with cells and as a closed loop between media changes. |
Polycarbonate luer fittings for Pharmed tubing assemblies | Value Plastics | MTLS210-9 | Secured to each end of cut Pharmed tubing for insertion into bichips. |
20 mL syringes, slip-tip | VWR Scientific us.vwr.com | BD302831 | Used for injection of cell suspension for seeding ECIS chips, as well as for feeding chips. |
0.1 dram snap-cap polypropylene microvials | Bottles Jars and Tubes, Inc. www.bottlesjarsandtubes.com | 30600 | Used to store 60 mg aliquots of L-15ex powdered media. |
60 mil Lexan fluidic ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. RTgill-W1 cells will be injected into the biochips and seeded chips will be placed in ECIS reader for testing. | |
Autoclavable Plastic Instrument Box 17 1/2" x 7 3/4" x 2 3/8" |
Medi-Dose EPS medidose.com | IB701 | Used to store the following; autoclaved plugs, biochips that have been cleaned, seeded biochips. |
Paper heat-seal sterilization pouches, 7 ½” x 13” | CardinalHealth www.cardinalhealth.com | 90713 | Used for autoclaving tubing and fittings and plugs. |
Quantos automated powder dispenser | Mettler Toledo www.mt.com | QB5 | Automated dispension of 60 mg aliquots of powdered L-15ex into 0.1 dram vials. |
ECIS reader | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Seeded biochip is inserted into the reader for conducting water toxicity testing. | |
3 X 5 metalized 2.5 mil polypropylene reclosable bags | Uline www.uline.com | S-16893 | Packaging and storage for both seeded biochips and powdered L-15ex media vials. |
Leatherman squirt ps4 | Amazon www.Amazon.com | Used to open powdered media vials. | |
1 gram silica gel desiccant packets | Uline www.uline.com | S-3902 | Put in polypropylene bags with L-15ex powdered media vials to prevent the powder from picking up moisture. |
Sterile 250 or 500 mL Nalgene bottles | Fisher Scientific www.fishersci.com |
09-740-25C or E | Hold cell suspensions for seeding ECIS chips in biohood. |
Plugs for biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Used to seal ports on biochips before storage @ 6°C. | |
Drains for ECIS biochips | Nanohmics, Inc. www.nanohmics.com | Custom-made by Nanohmics, Inc. Placed on 2 inner ports on biochips prior to insertion in ECIS reader. Allows for excess media to drain from channels during test injections. | |
Hemocytometer | Fisher Scientific www.fishersci.com |
S17040 | Needed for counting cells prior to adjusting cell suspension for injection into biochips. |
Brightfield microscope w/ 10X objective | Leitz Labovert | Any brightfield microscope is acceptable. | |
Class II biological safety cabinet | Any class II biological safety cabinet where cell culture can be performed under sterile conditions is acceptable. | ||
Microcentrifuge tubes, 0.6 mL | Fisher Scientific www.fishersci.com |
02-681-311 | Holds 1 mL of cell suspension prior to counting cells. |
Slip 10 cc red syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-R | Withdraws 9 mL of test water sample and used to inject sample into biochip. |
Slip 10 cc blue syringes | Procedure Products, Inc. www.procedureproducts.com | S/49S 30-B | Withdraws 9 mL of control water sample and used to inject sample into biochip. |
½ oz. clear pet plastic jar w/ white ribbed lined caps | SKS Bottle & Packaging, Inc. www.sks-bottle.com | 0605-30 | Sample vials used for mixing L-15ex powder and 10 mL of water sample for testing. |
50 mL sterile conical polypropylene centrifuge tubes | Fisher Scientific www.fishersci.com | 12-565-269 | Used to hold 40 mL aliquots of 10 ug/mL fibronectin @ -20 °C. |