일차 섬모는 다양한 신호 경로에 영향을 미칩니다. 포유류 달팽이관은 평면 세포 극성(PCP) 신호 전달을 검사하는 데 이상적입니다. 섬모 기능 장애는 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향, PCP 판독에 영향을 미칩니다. 우리의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달을 분석하는 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
최근 몇 년 동안 원발성 섬모는 수많은 신호 경로에 영향을 미쳐 발달 및 질병의 핵심 조절자로 부상했습니다. 섬모 기능과 관련이 있는 것으로 밝혀진 가장 초기의 신호 경로 중 하나는 평면 세포 극성(PCP) 신호라고도 하는 비표준 Wnt 신호 경로였습니다. 척추동물 발달 중 평면 세포 극성(PCP) 신호의 영향을 연구할 수 있는 가장 좋은 장소 중 하나는 포유류의 달팽이관입니다. 마우스 달팽이관의 PCP 신호 전달은 달팽이관 성장, 세포 패터닝 및 유모 세포 방향을 방해하며, 이 모든 것은 섬모 기능 장애의 영향을 받습니다. 이 프로토콜의 목표는 표현형 분석, 면역조직화학 및 주사 전자 현미경을 통해 발달 중인 포유류 달팽이관에서 PCP 신호 분석을 설명하는 것입니다. 수렴 및 확장의 결함은 달팽이관의 단축 및/또는 세포 패턴의 변화로 나타나며, 이는 발달하는 마우스 돌연변이에서 해부된 후 정량화할 수 있습니다. 입체섬모 다발 방향 및 키노실리아 길이 또는 위치의 변화를 관찰하고 면역형광 또는 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 정량화할 수 있습니다. 세포 신호 경로 및 기타 생물학적 현상에서 섬모 단백질의 역할에 대한 심층적인 통찰력은 세포 및 발달 생물학에 대한 이해와 표적 치료 전략의 개발에 매우 중요합니다.
서론
차 섬모는 대부분의 포유 동물 세포의 표면에서 연장 긴 미세 소관 기반의 부속 기관입니다. 차 섬모는 종종있는 항상 셀 당 여러가, 운동성 섬모와 혼동하고, 그 목적은 막 표면에서 유체를 이동하는 것입니다 수 있습니다. 차 섬모 대조적으로, 감각 역할을 채택하고 그 결과 또한 감각 섬모라고합니다. 일단 오래 잊고,이 세포 기관은 최근 인간의 유전 질환 1의 다수와의 연결의 결과로 '재발견'되고있다. 이상적 신호 소기관으로 위치 된 일차 섬모 수많은 시그널링 조직 항상성 및 질병뿐만 아니라 중요 이는 많은 경로,뿐만 아니라 개발이 과정을 조절하는 것으로 나타났다.
섬모 기능 장애와 연관되는 것으로 도시 제 1 시그널링 경로 중 하나가 평면 셀 극성 (PCP) 경로라고도 비정규 Wnt 신호 전달 경로이었다 > 3. 처음 초파리에서 확인이 신호 캐스케이드, 배아 중요하다; 통합 및 확장 프로세스 특히와 상피 (4)의 평면에서 세포의 올바른 방향에 대해. 조절 단백질의 집합 코어의 연속 신호는 궁극적으로 세포 골격 재 배열로 이어질 및 평면 5 상피 세포의 조정 편광 될 방향 신호를 변환합니다. 융합과 확장의 과정은 절대적으로 연장하는....
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프로토콜
사용하여 가장 일반적으로 CO 2 흡입 자궁 전위를 통해 기관 및 정부 지침과 규정에 따라 모든 동물을 안락사.
시약 1. 준비
참고 : 이전 시작에, 분석 수준의 화학 물질을 사용하는 모든 시약을 준비합니다. 달리 명시되지 않는 한 증류 분자 학년과 탈 이온수를 사용하여 솔루션을합니다.
- 인산염 완충 식염수 (1X PBS)는 : H 2 O 1 L에 PO 4 8g의 NaCl, 0.2의 KCl, 1.44g 나 2 HPO 4 0.24g KH 2를 용해하여 1X PBS의 1 L합니다 HCl을 7.4로 pH를 조정합니다. PBS 멸균 될 필요가없고, 실온에서 저장 될 수있다. 이 버퍼는 염화칼슘 2의 MgCl 2없이 유의하십시오.
- 파라 포름 알데히드 (4 % PFA는) : 환기 흄 후드에 1X PBS에 PFA의 4 % 용액을 준비합니다. 1X PBS의 1 L에 파라 포름 알데히드 분말 40g을 추가합니다. C 약 60 °로, 교반과 열을 용해하기 위해,천천히 수산화 나트륨은 pH를 상승하는 것이 현명 드롭 추가합니다. 분말이 용해되면, HCl로 7.4 pH를 조정 해 주어야합니다....
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결과
와우 해부 및 조직 준비
뇌의 제거 후, (그림 1A, 흰색 화살표)를 시각화 및 제거 할 수 있습니다 뒤에서 본 P0 마우스 머리, 뼈 미로, 사후 중간 라인 시상 해부.도 1b는 인공 머리를 가진 격리 된 뼈 미로를 보여줍니다 위쪽, 복부 (왼쪽)와 뒤에서 마주 지느러미 (오른쪽). 타원형 창에 흰색 화살표 포인트는있는 사람은 외부 연골을 제거 시작할 수 있습니다. 외측 연골이 완전히 제거되면, 노출 된 인공 덕트는, 그대로 (도 1C)을 관찰 할 수있다. 해부를 지원하기 위해 전정 영역을 통해 핀의 위치가 표시됩니다. 서로 다른 각도로 배치 된 두 개의 핀은 또한 조직을 고정하기 위해 사용될 수있다.도 1d는
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토론
분석을 위해 인공 조직을 준비 할 때, 명심 할 몇 가지 주요 사항이 있습니다. 우선, 유전 적 배경 차이는 필요한 분석에만 한배 새끼 컨트롤과 비교하게 인공 표현형을 수정할 수있다. 둘째, tectorial 막의 완전한 제거는 면역 조직 화학 최상의 이미지를 얻기 위해 필요한 및 SEM을 위해 필수적이다. tectorial 막은 불투명 한 구조 및 이미지가 더 도전하고, 그 아래에 직접 감각 상피의 세포를 모호하게 할 수 있습니다. 때때로 처리하는 동안, tectorial 막 머리 세포를 폭로, 다시 축소 할 수 있습니다. 이러한 경우에도 제거 강력히 권장합니다. 이 단계는 인내와 연습이 필요합니다. 셋째, 섬모 단백질, 고도로 압축 된 기초 신체에 지역화 특히 사람,에 대한 항체를 사용하여 면역 조직 화학 도전하고 최적화를 요구할 수 있습니다. permeabil을 강화, 항원 검색을 수행하는 것이 좋습니다이 단계 화되거나 또는 고정 농도의 시간을 감소시킨다. P1을 이후베이스 - 정점 구배 - kinocilium (인공 와.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계를 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자는 원고들의 중요한 평가 매튜 켈리, 티지 아나 Cogliati, 제시카 Gumerson, 우베 Wolfrum, Rivka Levron, 비올라 KRETSCHMER와 조이 맨을 감사하고 싶습니다. 이 작품은 Sofja Kovalevskaya에 상 (Humbodlt 재단)와 요하네스 구텐베르크 대학, 마인츠, 독일에 의해 투자되었다.
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재료
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| : 마이크로 해부 가위-직선 칼날 | 다양한 | ||
| 미세 집게(5번 및 55번) 및 무딘 집게 | 다양한 | ||
| 해부 현미경. | 다양한 | ||
| 비코팅 유리 현미경 슬라이드 | 다양한 | ||
| 현미경 커버 슬립 (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | 다양한 | ||
| 트랜스퍼 피펫 | 다양한 | ||
| Minutien 핀 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SEM 샘플 홀더 | tousimis | 8762 | |
| 주사 전자 현미경 스터드 | TED PELLA | 16111 | |
| PELCO 탭: 탄소 접착제 | TED PELLA | 16084-3 | |
| 형광 현미경 | 다양한 | ||
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| Kimwipe 티슈 | 다양한 | ||
| 미세 페인트 브러시 | |||
| 시약 | |||
| 1× 인산염 완충 식염수(PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
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| CaCl, 2 | |||
| 트리톤 X-100 | |||
| 일반 염소 혈청 | 다양한 | ||
| AffiniPure, Fab Fragment, 당나귀, 안티 마우스 IgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
| Fluoromount-G 마운팅 미디어 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 10× 행크스의 Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
| Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
| Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Ethanol 200 proof | 다양한 | ||
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| 항 Arl13b | 단백질 기술 | 17711-1-AP | 권장 농도 1:1,000 |
| 항 아세틸화 튜불린 (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | 제안 농도 1:800 |
| 항 감마 튜불린 (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | 권장 농도 1:200 |
| 항 Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | 권장 농도 1:500 |
| Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | 권장 농도 1:1000 |
| Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | 권장 농도 1:1,000 |
| anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | 권장 농도 1:250 |
| anti Gα i3 | Sigma-Aldrich | G4040 | 권장 농도 1:250 |
| Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | 권장 농도 1:300 - 1,000 |
| Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | 권장 농도 1:300 - 1,000 |
참고문헌
- Waters, A. M., Beales, P. L. Ciliopathies: an expanding disease spectrum. Pediatr Nephrol. 26, 1039-1056 (2011).
- May-Simera, H. L., Kelley, M. W. Cilia, Wnt signaling, and the cytoskeleton. Cilia. 1, 7(2012).
- Ross, A. J., et al.
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