우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스)로 코르티 성인 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 또한 형광 태그 항체 면역 염색을위한 절차를 보여준다. 함께 이들 기술은 달팽이관 검색된 유모 세포,지지 세포 및 다른 세포 유형의 연구를 허용한다.
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이 논문에서
요약
초록
내이의 달팽이관에 위치한 코르티 기관은 나선형으로 조직되어 있고 소리 감지를 위한 토노토피 구배를 가진 기계감각 유모 세포와 주변 지지 세포를 포함하고 있습니다. 쥐 달팽이관은 길이가 약 6mm이며 분석을 위해 종종 3개의 회전(정점, 중간 및 기저부)으로 나뉩니다. 세포 손실, 세포 분열 또는 모자이크 유전자 발현을 조사하려면 달팽이관의 전체 마운트 또는 표면 준비가 유용합니다. 이 해부 방법을 사용하면 면역염색 및 컨포칼 현미경과 결합하여 z축의 다른 평면에 있는 세포를 이미지화할 때 코르티 기관 내의 모든 세포를 시각화할 수 있습니다. 이러한 z-stack 이미지로부터 다중 광학 단면을 얻을 수도 있습니다. 또한, 전체 마운트 해부 방법은 주사 전자 현미경에 사용할 수 있지만 다른 고정 방법이 필요합니다. 여기에서는 코르티 기관을 3개의 온전한 달팽이관 회전(정점, 중간, 기저부)으로 분리하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 생후 1주일부터 성인까지의 마우스에 사용할 수 있으며 달팽이관의 석회화가 불완전한 신생아 샘플에 사용되는 기술과 다릅니다. 약간 수정된 버전을 사용하여 쥐 달팽이관을 박리할 수 있습니다. 또한 형광 표지된 항체를 사용한 면역 염색 절차를 시연합니다.
서론
측두골에 포함 된 내이의 나선형 모양의 달팽이관은 코르티, 포유 동물의 청각 감각 최종 기관의 장기 주택. 달팽이관 tonotopically 편성 일반적 혀끝, 중앙으로 분할하고, 기초가 정점 1베이스와 낮은 주파수 검출에 고주파 사운드 검출과 상이한 주파수 영역들에 대응하도록 설정 한. 헤어 셀, 코르티 기관의 mechanosensory 세포는 쥐 2,3 약 6mm 길이 달팽이관의 길이를 실행합니다. 이러한 셀 구조체 중심부의 청각 신경에 의해 처리되는 신호들로, 유체 충전식 멤브레인 미로를 통해 전송되는 음파의 기계적 에너지로 변환. 여기에 설명 된 기술은 (나이 일주일로부터 성인에 이르기까지의 샘플에 대해) 달팽이관의 석회화 후 코르티 기관의 전체 마운트를 제조하는 방법이 완료 제공한다. 우리는 또한 immunosta에 대한 방법을 제시한다전체 ining 인공 조직을 설치. 인공 와우 전체 마운트는 모든 유모 세포의 시각화 및 자연 공간 배치에서 지원하는 세포를 둘러싸는 매우 중요하며, 공 초점 현미경을 사용하여 세 가지 차원에서 분석 할 수 있습니다.
박사. 한스 엥 스트롬과 할로우 아데스는 원래 그들은 빠르게 현미경 분석 4 코르티 기관의 짧은 그대로 세그먼트를 보존, 수....
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프로토콜
윤리 문 : 동물 주제와 관련된 절차는 의학의 서던 일리노이 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
시간적 뼈 1. 추출
- 마우스 두개골 (13)의베이스에 시간적 뼈를 확인하고 표준 패턴 집게를 사용하여 두개골 신경을 멀리 쳤어요.
- 캡슐화 된 달팽이관을 제거하기 위해 귀의 캡슐의 끝에서 아래로 후부 반원의 운하에 반대 손으로 언론의 엄지 손가락으로 표준 패턴 집게를 놓습니다.
- 수동으로 엄지와 검지 손가락으로 또는 10.5 cm 미세 가위를 사용하여 두개골에서 시간적 뼈의 아래쪽 절반을 무료로 제공됩니다.
2. 임시 뼈를 포스트 - 수정
- 10 mM의 인산 완충 식염수에 희석 500 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (PBS)의 pH 7.4와 incub - (250)를 포함하는 2 ml의 마이크로 원심 튜브에 시간적 뼈를 배치20 시간 - 2 RT에서 먹었다.
참고 : 원형 또는 타원형 창에 PFA의 정점 캡 또는 주입의 어떠한 개구가 필요하지 않습니다. 유리 병에 16 % 농도에서 구입할 수 있습니다 메탄올 무료, 초순수, 전자 현미경 (EM....
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결과
우리는 세 가지 그대로 인공 회전 (정점, 중,베이스) 그림 1에 제시된 키 해부 단계, 석회화이다 인공 조직에서 같이 코르티 기관을 분리하는 방법을 제시한다. 개발의 첫 번째 출생 후 주의 석회화 중 마우스 달팽이관이 불완전하고 더 간단한 박리 법 (13)을 사용할 수있다. 코르티 기관의 P7에서 달팽이관과 눈물의 오래된 마우스 결과와 분쇄와 신생아 전체 마운트 해부 방법을 사용. 나선형 인대 / 측벽은 이제 더 단단히 부착되고 손상을 초래하지 않고 얻어 감각 상피로부터 박리 될 수 없다. 따라서 "성인"전체 마운트 해부 방법은 P6보다 오래된 샘플이 필요하다. 우리는 해부 헤어 셀 및 지원 세포 마커 (그림 2)와 면역 염색 된 P15 마우스 와우의 중간 차례의 예를 제시한다. 광 단면의 C또한, 전체의 실장 기술 (도 3)로 취득 될 수.......
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토론
성공적인 전체 마운트 해부 및 면역 염색에 대한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이러한 방법 중 하나를 수행하지만 전에, 인공 조직의 적절한 고정이 필요하다. 우리는 메탄올 무료, 초순수, EM 등급 PFA를 사용하는 것이 좋습니다. PFA는 메탄올과 면역의 품질을 감소 불안정의 pH의 흔적을 가질 수 분말했다. 다른 그룹은 유사한 해부 포름 알데히드 14-16를 포함하지 않는 수 사용하여 고정 제는 것을 보여 주었다. 고정의 길이도 중요 항체 다릅니다. 다른 사람들이 PFA 단지 1 시간 잘 작동하지 않는 동안 일부 항체 (그러나이 드문), O / N 고정을 허용 할 수 있습니다. 조직이 떨어져 떨어지는에서 고정 조직은 절개 방법에 대한 문제가 될 수 있습니다. 우리의 경험에서 3-4 시간 고정 적절한 고정을 제공하며, 일반적으로 청각 분야에서 사용되는 일차 항체의 대부분을 방해하지 않습니다.
"jove_content> 그것은 EDTA 차 항체를 방해 할 수있는 것이 가능.......액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 N000141310569(Office of Naval Research)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. Southern Illinois University School of Medicine Research Imaging Facility 장비는 National Center for Research Resources-Health(S10RR027716)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
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참고문헌
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information process....
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